李婷婷，刘 艳，冯立影，梁晓玲，赵海峰，刘高峰



刺五加注射液对大鼠华法林抗凝作用的影响

李婷婷，刘 艳，冯立影，梁晓玲，赵海峰，刘高峰*

目的 研究刺五加注射液对大鼠华法林抗凝作用的药效学和药动学影响，为临床合理用药提供参考。方法 将Wistar雄性大鼠随机分成空白对照组(A组)、刺五加注射液给药组(B组)、华法林对照组(C组)、华法林-刺五加注射液联合给药组(D组)，4组大鼠连续腹腔注射生理盐水或刺五加注射液(15 mL/kg)14 d。第8天，A、B两组灌胃给予相同剂量的生理盐水，C、D两组灌胃给予华法林溶液(0.2 mg/kg)，并于设定的一系列时间点取血。用血凝分析仪测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)，并计算国际标准化比值(INR)。用UPLC-MS/MS法联合手性色谱柱技术测定血浆中华法林(包括S-型和R-型)浓度，用DAS 2.0软件计算药代动力学参数。结果 刺五加注射液对PT、APTT及INR无明显影响；与华法林对照组比较，合用刺五加注射液后，华法林(包括S-型和R-型)的药动学参数Cmax、AUC0-t和AUC0-∞等显著升高(P<0.05或P<0.01)，药效学参数PT及INR显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论 刺五加注射液可减慢华法林(包括S-型和R-型)的代谢，使华法林抗凝作用增强。提示临床用药时应尽量避免两药联合应用，以避免出血风险，如必须联用，应密切监测。

华法林；刺五加注射液；抗凝作用；药物相互作用

0 引言

华法林是应用最广泛的口服抗凝药物，主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，防止血栓的形成与发展，如防止深静脉血栓、血栓性静脉炎，降低肺栓塞的发病率与病死率，减少外科大手术、风湿性心脏病人工瓣膜置换术等的静脉血栓发生率[1-2]。华法林因其蛋白结合率高、代谢依赖细胞色素P450酶及治疗窗窄等特点，易与其他药物发生相互作用，导致抗凝不足或出血不良反应增加，临床用药存在高风险性[3-4]。

刺五加注射液是临床常用的中药注射剂，具有平补肝肾、益精壮骨之功效，可用于治疗冠心病心绞痛[5]、肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作、脑栓塞、脑动脉硬化和脑血栓形成等[6]。由于其在心脑血管领域应用较多，与华法林联合应用时是否对华法林的抗凝作用产生影响，目前尚无相关报道。本研究将从药效学和药动学两个角度，探讨刺五加注射液对华法林抗凝作用的影响，为两药联用是否会产生药物相互作用提供实验依据，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用清洁级Wistar大鼠，雄性，体重(200±20)g，购自哈尔滨医科大学实验动物学部，合格证号：SYXK(黑)2006-033。

1.2 药品与试剂 刺五加注射液(黑龙江乌苏里江制药有限公司，规格：100 mL/瓶，批号：20121211)；华法林钠片(上海信谊药厂有限公司，华法林钠2.5 mg/片，批号：18130503)；华法林钠标准品(中国药品生物制品检定所，批号：101163-2001001)；S-华法林标准品、R-华法林标准品(加拿大TRC股份有限公司，纯度98%)；甲氯噻嗪标准品(中国药品生物制品检定所，批号：101227-201101)；PT试剂(上海太阳生物技术有限公司，批号：105216)；APTT试剂(上海太阳生物技术有限公司，批号：111037)；乙腈、甲醇、乙酸铵为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 Waters UPLC XEVO TQ MS(美国waters公司)；SK5002双通道血凝分析仪(深圳市盛信康科技有限公司)；230V-EU微型漩涡混合仪(美国爱迪生公司)；MC-19R冷冻离心机(昊诺斯生物公司)；KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HGC-12A型氮吹仪(合肥信诺仪器有限责任公司)。

1.4 动物实验

1.4.1 华法林溶液的配制 取1片华法林钠片(2.5 mg/片)，置于研钵中，加少量吐温80共研，加入50 mL纯化水混匀，所配溶液华法林钠的浓度为0.05 mg/mL。

1.4.2 动物分组与给药 将Wistar大鼠随机分成空白对照组(A组)、刺五加注射液给药组(B组)、华法林对照组(C组)、华法林-刺五加注射液联合给药组(D组)，每组8只，4组大鼠在连续14 d内腹腔注射生理盐水(A组、C组)或刺五加注射液15 mL/kg(B组、D组)。第8天，A、B两组大鼠灌胃给予相同剂量的生理盐水，C、D两组大鼠均同时灌胃给予华法林溶液0.2 mg/kg，并于设定的一系列时间点断尾取血。

1.4.3 血浆样品的采集与处理 药效学研究血样的采集与处理：4组大鼠灌胃给予生理盐水或华法林溶液后，在0、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分别取血0.1 mL，置于加枸橼酸钠抗凝液的离心管中，3 000 r/min离心15 min，取上清血浆测定PT及APTT。

药动学研究血样的采集与处理：C、D两组大鼠灌胃给予华法林溶液后，在0.5、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分别取血0.3 mL置于加肝素抗凝液的离心管中，9 000 r/min离心10 min。准确取大鼠血浆100 μL，加入甲氯噻嗪内标溶液(2 μg/mL)50 μL后，加20 μL乙酸涡旋1 min，再加入3 mL乙酸乙酯，涡旋振荡2 min后，以3 500 r/min离心5 min，取乙酸乙酯层，40 ℃氮气流下吹干，100 μL 50%乙腈水复溶，涡旋振荡1 min，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液5 μL注入进样杯中，测定华法林(S-型和R-型)的血药浓度。

1.5 凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定 取适量PT试剂置于血凝分析仪试剂预温位中，37 ℃下预热10 min。吸取20 μL血浆移至血凝分析样品杯底部，预温3 min，然后放入测试通道中，用联机专用微量移液器吸取40 μL相对应的PT试剂后，测定PT值。

吸取20 μL血浆移至血凝分析仪样品杯底部，加入20 μL的APTT试剂，置于血凝分析仪样品预温位，预温5 min，然后放入测试通道中，用联机专用微量移液器吸取20 μL的氯化钙试剂，测定APTT值。

1.6 血浆中S-华法林和R-华法林浓度的测定

1.6.1 标准品溶液的配制 S-华法林标准品溶液的配制：精密称取S-华法林标准品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的标准品溶液。R-华法林标准品溶液的配制：精密称取R-华法林标准品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的标准品溶液。甲氯噻嗪内标溶液的配制：精密称取甲氯噻嗪10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的内标溶液。

1.6.2 色谱条件 手性色谱柱(Astec CHIROBIOTICTMV，5 μm，2.1 mm×100 mm)，柱温28 ℃，流动相5 mmol/L醋酸铵(pH 4.0)∶乙腈=85∶15，流速0.2 mL/min，进样体积为5 μL。

1.6.3 质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，负离子方式检测，扫描方式为多反应监测(MRM)，毛细管电压0.4 kV,去溶剂氮气的温度400 ℃，流速为650 L/h。华法林用于定量分析的离子碎片m/z为307.1→161.0，锥孔电压35 V,碰撞能量21 eV；甲氯噻嗪m/z为357.9→321.9，锥孔电压35 V，碰撞能量14 eV。

2 结果

2.1 刺五加注射液对大鼠体内华法林抗凝作用的药效学影响 用血凝分析仪分别测定4组大鼠的PT、APTT值，并根据PT值计算INR值。APTT Emax用来表示APTT的峰值，APTT Tmax用来表示APTT的达峰时间。结果分别见图1、图2和表1。

图1 刺五加注射液对华法林药效学影响试验PT变化曲线

组别只数APTTEmax(s)APTTTmax(h)A组832．14±1．5136(24～48)B组831．99±1．7036(24～48)C组834．96±1．5936(24～48)D组837．37±3．5636(24～48)

2.2 刺五加注射液对大鼠体内华法林抗凝作用的药动学影响

2.2.1 S-华法林药代动力学参数及药时曲线 华法林对照组、华法林-刺五加注射液联合给药组中的S-华法林药代动力学参数如表2所示，药时曲线如图3所示。

图2 刺五加注射液对华法林药效学影响试验INR变化曲线

药代动力学参数C组D组Cmax(ng/mL)416．95±43．35494．37±58．09∗t1/2(h)32．46±2．0035．30±2．82AUC0⁃t(ng·h/mL)14231．63±4498．6123914．28±8787．67∗AUC0⁃∞(ng·h/mL)17142．82±4064．6829551．88±9672．99∗CL/F[mL/(h·kg)]0．0014±0．000520．0012±0．00045

注：与C组比较，*P<0.05

图3 华法林对照组和华法林-刺五加注射液联合给药组S-华法林的血药浓度-时间曲线图

2.2.2 R-华法林药代动力学参数及药时曲线 华法林对照组、华法林-刺五加注射液联合给药组中的R-华法林药代动力学参数如表3所示，药时曲线如图4所示。

表3 刺五加注射液与华法林联合给药后大鼠R-华法林的药代动力学参数变化(n=8)

注：与C组比较，*P<0.05，**P<0.01

图4 华法林对照组和华法林-刺五加注射液联合给药组R-华法林的血药浓度-时间曲线图

3 讨论

本研究从药效学和药动学两个方面评价了刺五加注射液对华法林抗凝作用的影响。采用血凝分析仪测定凝血指标PT、APTT值，并根据PT值计算INR值。通过对华法林-刺五加注射液联合给药组和华法林对照组的药效学参数进行统计学分析和比较，评价刺五加注射液对华法林抗凝作用的药效学影响；应用UPLC-MS/MS法联合手性色谱柱技术测定S-华法林和R-华法林的血浆药物浓度，用DAS 2.0软件分别计算药代动力学参数，通过对华法林-刺五加注射液联合给药组和华法林对照组的药动学参数进行统计学分析和比较，评价刺五加注射液对华法林抗凝作用的药动学影响。

由药效学研究结果可见，刺五加注射液给药组与空白对照组比较，PT、APTT及INR值均无统计学差异，表明刺五加注射液本身对凝血无影响。而刺五加注射液与华法林联合给药组和华法林对照组比较，联合给药组的PT值延长，INR值增大(P<0.01)，APTT峰值尽管没有统计学差异，但有延长的趋势，提示刺五加注射液使华法林抗凝作用增强，而且主要通过影响外源性凝血途径。

药动学研究结果显示，刺五加注射液和华法林联用后，可使华法林的药动学参数发生改变，其中S-华法林的Cmax升高了18.57%(P<0.05)，

AUC0-t升高了68.04%(P<0.05)，AUC0-∞升高了72.39%(P<0.05)；R-华法林的Cmax升高了29.7%(P<0.01)，t1/2延长了31.27%(P<0.01)，AUC0-t升高了78.85%(P<0.05)，AUC0-∞升高了88.08%(P<0.05)。提示刺五加注射液可抑制华法林的代谢，且对S-型和R-型均有影响。华法林为外消旋异构体，其S-型和R-型手性对映体活性不同，代谢途径亦不同，S-华法林主要经CYP2C9酶代谢，R-华法林主要经CYP1A2和CYP3A4酶代谢。本课题组前期研究表明，刺五加注射液对CYP2C9和CYP3A4有抑制作用[7]，与华法林合用时，可由于其对CYP450酶的抑制作用而使华法林代谢减慢，抗凝作用增强。

结合药效学和药动学结果综合分析，刺五加注射液与华法林联合应用时，可减慢华法林代谢而导致INR增大，抗凝作用增强，两药联用可产生代谢性药物相互作用，使华法林出血风险增加。提示临床用药时，应尽量避免刺五加注射液和华法林联合应用，以避免出血性不良反应的发生；如必须联用，应密切监测，并根据具体情况调整华法林剂量。

[1] 康俊萍.华法林临床应用要点[J].中国医刊,2014,49(1):11-14.

[2] 刘寅强.心脏瓣膜置换术后华法林个体化抗凝研究[D].昆明:昆明医科大学博士论文,2013.

[3] 郑必龙,刘俊.华法林抗凝血作用及影响因素分析[J].安徽医药,2013,17(11):1975-1977.

[4] 戴烨,汪宇.华法林的用药教育[J].临床合理用药,2013,6(1):77-78.

[5] 王卫民.刺五加注射液治疗冠心病心绞痛的临床观察[J].北方药学,2013,10(4):75.

[6] 吕朋飞.刺五加注射液治疗脑梗塞的应用价值[J].医学信息,2015,28(13):42.

[7] 曾超,刘艳,刘高峰,等.刺五加注射液对大鼠肝微粒体四种CYP450亚型酶活性的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2012,17(2):164-170.

Influence of ciwujia injection on anticoagulant effect of warfarin in rats

LI Ting-ting,LIU Yan,FENG Li-ying,LIANG Xiao-ling,ZHAO Hai-feng,LIU Gao-feng*

(Department of Pharmacy,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Key Laboratory of University in Heilongjiang Province,Harbin 150086,China)

Objective To study the effects of ciwujia injection on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of warfarin in rats,and to provide reference for rational drug use of combination therapy.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups,blank control group (group A),ciwujia injection group (group B),warfarin control group (group C),warfarin combined ciwujia injection group (group D),eight rats in each group.The rats of four group swere administered physiological saline or ciwujia injection (15 mL/kg) by caudal vein for 14 consecutive days.On the 8th day,rats in group A and group B were orally administered with the same dose of physiological saline,and rats in group C and group D were orally administered with warfarin solution (0.2 mg/kg).The blood samples were collected from the caudal veins at different time points.The prothrombintime (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) of the blood samples were determined by coagulation analyzer,and the blood concentrations of S-warfarin and R-warfarin were determined by UPLC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.Results Ciwujia injection had no effect on PT,APTT and INR,but ciwujia injecion combined with warfarin could increase the blood concentrations of warfarin (including S-type and R-type,P<0.05 orP<0.01)and the valne of PT and INR significantly (P<0.05 orP<0.01).Conclusion Ciwujia injection could decrease the metabolism of warfarin (including S-type and R-type),and increase the anticoagulant effect.Therefore,the combination use of the two drugs should be refrained,in order to avoid the risk of bleeding.Special monitoring should be carried out if the combination therapy is used.

Warfarin;Ciwujia injection;Anticoagulant effect;Drug interactions

2015-08-31

哈尔滨医科大学附属第二医院药学部，哈尔滨

150086

国家自然科学基金项目(81173659)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511003

*通信作者