张　芸　纪惜銮　罗朝霞　杨　顺　刘晓雷　姜　舒

(1.深圳市茵冠生物科技有限公司，广东 深圳　518000；2.中国科学院深圳先进技术研究院，广东 深圳　518000)

金属硫蛋白修饰的间充质干细胞治疗铅中毒*

张芸1纪惜銮1罗朝霞1杨顺1刘晓雷2姜舒1

(1.深圳市茵冠生物科技有限公司，广东 深圳518000；2.中国科学院深圳先进技术研究院，广东 深圳518000)

摘要：目的研究过表达金属硫蛋白的人脂肪间充质干细胞(MT-hADSCs)对铅中毒小鼠排铅的作用及机制。方法 实验分为空白对照组、铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒组和病毒感染组，空白对照组小鼠给予生理盐水，其他组小鼠给予1 mg/kg醋酸铅连续于实验第1-10 d腹腔注射，第11 d各组分别给予生理盐水、hADSCs、空载慢病毒感染的hADSCs、MT - hADSCs注射，观察14 d后处死小鼠，检测血铅浓度、血清超氧化物歧化酶( SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、脑组织Caspases 3和Bcl - 2蛋白表达。结果铅中毒小鼠血铅显著升高，血清SOD活性显著下降，血清MDA含量显著升高。病毒感染组与铅中毒模型组相比，血铅显著下降，血清SOD活性显著升高，血清MDA含量显著下降，脑海马DG区细胞actived caspase 3表达明显下降。结论MT - hADSCs能促进铅中毒小鼠排铅，提高其SOD活性和降低MDA含量及Caspases 3蛋白表达，从而减少细胞氧化损伤和凋亡。

关键词：金属硫蛋白；人脂肪来源间充质干细胞；铅中毒

铅是一种具有神经毒性的重金属元素，随着工业和其他行业的迅速发展, 铅被大量使用, 铅污染已经成为各个领域所面对的紧迫向题。但是，至今为止尚无特别有效的方法阻止人对铅元素的吸收。

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是指一类低分子量、高巯基含量(20%~30%)的活性肽[1]，对人体的正常生理代谢、内环境的稳定、组织和器官各种生理功能的正常进行起着非常重要的作用。MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用[2]。

脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs)是一种来源于人脂肪组织的成体干细胞，取材容易、来源丰富，具有自我更新能力、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征[3]，并且具有稳定生长和增殖、促进组织修复的能力，在心肌缺血、神经系统疾病、组织工程等领域中有着很好的应用前景[4]。

本实验通过将携带MT基因的hADSCs移植铅中毒小鼠模型，探讨MT蛋白对排铅的影响及作用机制，评估MT - hADScs应用于促排铅的安全性和有效性，为推动MT - hADScs作为促排铅药物进行临床转化应用提供实验基础和理论依据。

1材料与方法

1.1 动物

清洁级C 57雄性小鼠(广东省实验动物中心)，40只，体重18 - 22 g，购自广东省实验动物中心。小鼠饲以普通饲料，自由饮水。

1.2 药品与试剂

国产醋酸铅，实验前用生理盐水稀释，浓度为1 mg/ml；博晖全血铅镉元素检测试剂(改进型)购自北京博晖创新光电技术股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒和丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物科技有限公司；兔源Anti - Bcl2A1 antibody、兔源Anti - active Caspase 3 antibody、小鼠源Anti - metallothionein antibody均购自Abcam。

1.3 仪器

微量元素检测仪(BH 2100钨舟原子吸收光谱仪)购自北京博晖创新光电技术股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1分组与给药将40只小鼠分为5组，每组8只，分别为空白对照组、铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒组、病毒感染组。空白对照组小鼠腹腔注射等量0.9%的氯化钠注射液；铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒组、病毒感染组采用醋酸铅腹腔注射染毒法构建小鼠铅中毒模型，1次/天，连续10 天，每日的染毒剂量为10 mg/kg。末次染铅24 h后，空白对照组和铅中毒模型组小鼠经尾静脉注射生理盐水1ml，单纯细胞组、空载病毒组和病毒感染组小鼠分别经尾静脉给予5×105hADSCs、空载慢病毒感染的hADSCs和MT - hADSCs各1 ml，14 d后处死小鼠取血和脑组织。从实验开始，每天进行常规观察，包括动物外观、体征、进食量、行为活动等，每天称体重1次。

1.4.2 小鼠血铅浓度测定各组血液样本采用微量元素检测仪(BH 2100钨舟原子吸收光谱仪)，以及博晖全血铅镉元素检测试剂(改进型)进行血铅浓度检测。

1.4.3小鼠血清SOD活性和MDA含量测定分别按照SOD和MDA测试盒说明书操作，测定小鼠血清SOD活性和MDA含量。

1.4.4 小鼠脑组织Caspases 3、Bcl-2蛋白表达测定各组小鼠脑组织用4% PFA灌流固定，25%蔗糖脱水72 h，接着冰冻切片(30 μm)。收集包含脑海马组织的切片，做免疫组化分析。0.3% PBST破膜处理20 min，10%正常山羊血清封闭40 min。加Bcl - 2、caspase 3-抗(工作浓度1∶500)孵育1 h，PBS洗3遍，每次10 min。加二抗(工作浓度1∶100)孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min。贴片晾干后加含有DAPI的封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.5 统计学处理

2结果

2.1安全性评估

实验期间，各组动物活动、进食、生长正常，无小鼠死亡。各组小鼠的初始平均体重相近,实验结束时，各组小鼠的平均体重无显著差异。细胞输注部位未见红肿、硬结、破溃等。

2.2 MT - hADSCs对铅中毒小鼠血铅含量的影响

连续10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸铅，导致小鼠血铅显著升高，铅中毒模型组与空白对照组相比血铅含量显著升高(P<0.05)，单纯细胞组、空载病毒感染组与铅中毒模型组相比，血铅含量明显下降，有显著差异(P<0.05)，病毒感染组与铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒感染组相比，血铅显著下降(P<0.05)，见图1。

图1　MT-hADSCs对铅中毒小鼠

*P<0.05 vs 空白对照组；**P<0.05 vs 铅中毒模型组；

#P<0.05 vs 铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒组

2.3MT - hADSCs对铅中毒小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响

连续10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸铅，导致小鼠血清SOD活性显著下降，血清MDA含量显著升高，病毒感染组与铅中毒模型组相比，血清SOD含量显著升高，血清MDA含量显著下降(P<0.05)，而单纯细胞组、空载病毒感染组相比铅中毒模型组MDA含量有显著差异(P<0.05)，见表1。

2.4 MT - hADSCs对铅中毒小鼠脑组织Caspases 3、Bcl - 2蛋白含量的影响

连续10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸铅未发现影响脑海马DG区的神经发生，各个组的DG区均检测到均匀致密表达的Bcl - 2。

表1　MT - hADSCs对铅中毒小鼠

*P<0.05 vs 空白对照组；**P<0.05 vs 铅中毒模型组；#P<0.05 vs 铅中毒模型组、单纯细胞组、空载病毒组

A 空白对照组；B 铅中毒模型组；

铅中毒模型组actived caspase 3表达明显增强，其他四组actived caspase 3的表达未检测到明显的增强。

A 空白对照组；B 铅中毒模型组；

3讨论

铅是一种作用于全身的多亲和性毒物，对人体产生多系统、多器官的损伤。铅进入体内后难以降解，可与酶或蛋白分子中许多基团如巯基、羧基、咪唑基等结合，并破坏体内其他二价金属元素[5]，从而对机体造成损害。至今为止尚无特别有效的方法阻止人对铅元素的吸收，目前主要采用排毒、强身、调理、预防等方式减少铅元素的吸收，临床上治疗铅中毒首选药物是依地酸二钠钙，其次是二已烯二胺五乙醇三钠钙和二硫醇钠，但这些化学药物不能长期使用，而且对几乎所有金属都具有络合作用，会同时造成对人体有益的金属丧失，如锌、铜等[6]。

MT的巯基基团(-SH)能强烈螯合有毒重金属汞、铅、镉、砷等，其中螯合铅的强度比锌大200倍，而螯合镉的强度又比铅大10倍，从而有效地清除这些有毒重金属，使它们无法毒害人体，同时对体内锌等微量元素无影响，这对保护大脑、肝、肾等人体重要器官具有极其重要意义。多项研究表明MT在重金属解毒方面具有显著效果，但由于MT结构与功能复杂性，目前对MT的重金属解毒机制认识尚不明确，普遍认为MT对重金属的解毒机制主要包括减少机体有害重金属存在和修复重金属引起的机体损伤两个方面，其作用途径包括金属离子代谢调节[7]、修复重金属氧化损伤[8]、提高重金属耐受性[9]和促进维生素吸收[10]等。

本实验将携带MT基因的MT - hADSCs移植治疗铅中毒小鼠，结果显示各实验组小鼠的活动、进食、生长未受到影响，各组小鼠平均体重在实验前后无显著差异，且细胞输注部位无不良反应，表明MT - hADSCs应用于治疗铅中毒小鼠是安全的，无明显毒副作用。铅中毒小鼠接受MT - hADSCs输注后，检测到血铅和血清MDA含量显著下降，血清SOD活性显著升高， 脑组织actived caspase 3表达下降，提示MT - hADSCs通过降低小鼠体内铅含量，减轻铅对SOD活性的抑制作用及体内超氧阴离子自由基的蓄积，进而降低因体内自由基作用于脂质发生过氧化反应而产生具有细胞毒性的MDA的含量，减少细胞氧化损伤和细胞凋亡。

本实验结果提示MT - hADSCs用于促排铅治疗的临床前评价是安全有效的，为推进MT - hADSCs作为促排铅药物进行临床转化应用提供了实验基础和理论依据，为临床治疗铅中毒提供一种更为安全有效的方法，但其促排铅及对机体的保护机制尚有待进一步研究。

参考文献：

[1]Swindell WR. Metallothionein and the biology of aging[J]. Ageing Res Rev, 2011, 10(1): 132-145.

[2]Kusakabe T, Nakajima K, Suzuki K, et al. The changes of heavy metal and metallothionein distribution in testis induced by cadmium exposure[J]. Biometals, 2008, 21(1): 71 - 81.

[3]Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J]. Blood, 2005, 105(4): 1815 - 1822.

[4]聂绪强，陈怀红，唐宁，等. 脂肪干细胞的共培养及其分化应用概述[J]. Chin J Biotech, 2011, 27(8): 1121-1131.

[5]孙永虎，古桂雄，洪庆成. 儿童铅负荷对血清中SoD、NO、NSE的影响[J]. 工业卫生与职业病，2007，33(4):229-232.

[6]杨树，陈立，尹艳艳，等. 喷替酸锌钠对铅中毒小鼠的驱铅作用研究[J]. 解放军药学学报，2011，27(2)：147-149.

[7]王磊. 镉胁迫对泥鳅的毒理效应及金属硫蛋白基因表达的影响[D]. 苏州大学，2012.

[8]路浩，刘宗平，赵宝玉. 金属硫蛋白生物学功能研究进展[J]. 动物医学进展，2009，01：62-65.

[9]徐炳政，张东杰，王颖，等. 金属硫蛋白及其重金属解毒功能研究进展[J]. 中国食品添加剂，2014，5:171-175.

[10] Hannon T B. Heavy Metal Poisoning[J]. Health, 2014, 01:19-20.

Metallothionein modified mesenchymal stem cells to treat lead poisoning

ZHANGYunJIXi-luanLUOZhao-xiaYANGShunLIUXiao-leiJIANGShu

(Shenzhen Yinguan Biotechnology Co., Ltd. Shenzhen 578000，China)

Abstract:Objective: studied between the expression of metallothionein in human adipose-derived mesenchymal stem cells (MT-hADSCs) Excretion of lead poisoning in mice and its mechanism. Methods: were divided into blank control group, model group, lead poisoning, simple cell group, viral load group and viral infection, mice were given saline control group, the other group of mice administered 1 mg / kg of lead acetate in a row in the first experiment 1-10 d intraperitoneal injection, the first 11 d of each group were given saline, hADSCs, load lentivirus infection hADSCs, MT - hADSCs injection, mice were sacrificed observed after 14d, testing blood lead levels, serum superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) in brain tissue Caspases 3 and Bcl - 2 protein expression. Results: blood lead poisoning in mice significantly increased serum SOD activity was significantly decreased, significantly increased the content of MDA. Compared with the model group, lead poisoning, blood lead was significantly decreased viral infection group, significantly increased the activity of SOD significantly decreased the content of MDA, hippocampus DG zone cells actived caspase 3 expression was significantly decreased. Conclusion: MT - hADSCs Lead Poisoned Mice can promote and improve its SOD activity and lower MDA content and 3 protein Caspases, thereby reducing cellular oxidative damage and apoptosis.

Keywords:metallothionein; human adipose-derived mesenchymal stem cells; lead poisoning

(收稿日期2015-9-12)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.12.012

中图分类号：R135.1

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)12-1353-03

作者简介：张芸(1973—)，女,湖南永州人，副研究员，硕士,主要从事细胞生物技术创新研发和转化应用工作。 通讯作者：姜舒，女，博士。