江洁冰, 周培岚, 郑志兵, 苏瑞斌

(1. 广西医科大学药学院, 广西 南宁 530021; 2. 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室, 北京 100850)

阿片受体泛素化机制及其对受体功能的影响

江洁冰1,2, 周培岚2, 郑志兵1,2, 苏瑞斌1,2

(1. 广西医科大学药学院, 广西 南宁 530021; 2. 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室, 北京 100850)

阿片受体是一类重要的G蛋白偶联受体(GPCR)，是内源性阿片肽及阿片类药物结合的靶点，阿片受体激活后对神经系统、免疫及内分泌系统具有调节作用。但阿片受体在反复激活后，容易出现耐受，导致阿片成瘾。受体的内吞和再循环对受体复敏具有重要意义。近年来研究发现，受体的泛素化修饰参与了GPCR的转运过程，并且多数配体作用于阿片受体后，受体的泛素化水平明显升高。将阿片受体的泛素化位点突变后，对不同阿片受体亚型的内吞和降解过程产生了不同的影响，进而影响了阿片受体的信号转导过程。本文着重对阿片受体3种亚型的泛素化修饰特点及泛素化对受体转运的调节作用进行综述。

G蛋白偶联受体; 泛素化; 阿片受体; 溶酶体

阿片受体作为G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPCR)重要成员，对神经系统、免疫及内分泌系统具有调节作用。阿片类药物是目前最强且常用的中枢镇痛药。但是阿片受体在阿片类药物长期作用后，容易出现耐受，机体表现为成瘾，即出现阿片依赖。近年来，对阿片成瘾的机制有许多进展，包括其他非阿片系统对阿片受体的调节和受体后信号分子对阿片受体的调节等，但阿片受体在激动剂作用后的内吞再循环仍然是影响阿片成瘾的关键所在。阿片受体翻译后修饰也是影响阿片受体功能的重要因素，主要包括糖基化、棕榈酰化、磷酸化[1-2]以及泛素化[3-4]等。目前对阿片受体磷酸化研究最为深入，磷酸化的受体与β拘留蛋白(β-arrestin)结合后与G蛋白脱偶联和内吞，进而与笼形蛋白结合后进入内涵体，其中部分受体进入溶酶体降解，部分脱磷酸化恢复到膜上，后者与受体的复敏关系密切。近年来，对阿片受体泛素化的研究有了较大进展。研究发现，泛素化不仅能使受体靶向进入蛋白酶体降解，对阿片受体内吞及后续转运也有重要作用。本文主要总结了泛素化对阿片受体转运功能的调节作用，有助于阐明阿片耐受和依赖机制。

1 泛素化的可能机制及对GPCR转运的调节作用

泛素，又称泛肽，是一个由76个氨基酸残基组成的小蛋白，泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程，具体来说是指泛素与底物蛋白赖氨酸残基共价结合，由泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(ubiquitin-ligase，E3)相继催化完成。在ATP存在的情况下，泛素被E1激活，并结合E2，后经E3直接或间接传递至底物蛋白的ε-氨基[5]。基因报告显示，人类表达2种E1、至少38种E2和600～1000种E3，提示底物蛋白泛素化的特异性主要取决于E3连接酶与底物间的相互作用[6-7]。蛋白的泛素化修饰是高度动态可逆的过程，去泛素化酶能特异性地断开泛素链和底物蛋白间的异构肽键[4-5]，使底物蛋白实现去泛素化。泛素的连接方式主要包括单泛素化、多泛素化和多聚泛素化[5-6]。底物蛋白单个或多个赖氨酸位点连接单个泛素分别称为单泛素化或多泛素化。多种胞膜受体的内吞运输由单泛素化或多泛素化介导[8-9]。例如，酵母肽转运体Ste6和信息素α因子受体Ste2发生单泛素化，能够调控膜受体内吞和降解；酵母因子受体Ste3不仅发生单泛素化，也发生多泛素化，后者能加速受体降解。泛素本身有7个赖氨酸残基(K)，分别位于第6, 11, 27, 29, 33, 48和63位点，这些赖氨酸残基连接泛素后形成不同的泛素链，底物蛋白与泛素链连接后称为多聚泛素化，如K48-多泛素链及K63-多泛素链。不同位点的多聚泛素化介导的反应有所不同，其中K48-多泛素链通常介导底物蛋白进入26S蛋白酶体发生降解，K63-多泛素链则主要参与非蛋白酶体降解功能，如DNA损伤修复[10]、转导调节[11]及受体内吞运输等。大量研究表明，多种GPCR发生泛素化，且其泛素化在受体转运过程中发挥重要作用[4-6]。对于某些典型的哺乳类GPCR，如β2-肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor, β2AR)、趋化因子受体4(chemokine receptor 4, CXCR4)、V2加压素受体、蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2, PAR2)及速激肽1型受体等。泛素化不是受体内吞必须的，但在靶向内吞受体进入溶酶体或蛋白酶体降解过程中发挥必不可少的作用[12-19]。研究发现，GPCR通常以经典的内涵体分类转运复合体(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)途径由内涵体进入溶酶体降解。ESCRT途径包含4种不同蛋白即ESCRT-0, ESCRT-Ⅰ, ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ以及一些附属因子如笼形蛋白和含AAA-ATP酶的液泡分选蛋白4 (vacuolar protein-sorting 4，VPS4)，它们有序协调地发挥功能，将泛素化底物运至多泡体的管腔囊泡。ESCRT-0由肝细胞生长因子调控酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate, HRS)和信号转导接头分子(signal-transducing adaptor molecule, STAM)亚单元组成，两亚单元均含有泛素化相互作用位点乏素结合域(ubiquitin-binding domain，UBD)，能识别并招募泛素化受体进入ESCRT途径，且能结合笼形蛋白。ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ含有UBD，通过UBD与泛素化受体发生相互作用，而ESCRT-Ⅲ 缺乏UBD，不能结合泛素化受体，主要在管腔囊泡分裂中发挥重要作用。配体激活GPCR发生泛素化后，受体内吞进入早期内涵体，相继结合ESCRT-0, ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅲ后，受体由早期内涵体传递至多泡体；GPCR在进入多泡体前发生去泛素化，去泛素化的GPCR在ESCRT-Ⅲ调控下运输到多泡体的管腔囊泡中，含AAA-ATP酶的VPS4提供能量，保证ESCRT途径循环进行。这就是经典的ESCRT途径[3,7,20]。某些GPCR以ESCRT机制进入溶酶体依赖于受体泛素化，如β2AR[14], CXCR4[16]和PAR2[18]等；另外一些受体如PAR1[21]和δ-受体[22]等，在突变泛素化位点后不影响其进入溶酶体，其中δ-受体是通过ESCRT机制进入溶酶体，而PAR1进入溶酶体通过非ESCRT机制，提示某些GPCR进入溶酶体降解的过程中，泛素化和ESCRT机制不是必须的，可能存在其他机制参与调控受体降解。

2 泛素化对阿片受体转运的调节作用

阿片受体主要包括μ, κ和δ 3种亚型，其氨基酸序列同源性高达60%，跨膜区氨基酸序列相对保守，主要差异在于胞外氨基端、胞内环及胞内羧基端[23]。与受体磷酸化类似，阿片受体在配体作用后也会发生泛素化修饰。激活的阿片受体发生构象改变，引发一系列调控过程，先是G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)刺激受体磷酸化，随后招募β-拘留蛋白，受体与Gi/Go型蛋白脱偶联后结合AP-2、网格蛋白等形成复合物，出现受体内吞，β-拘留蛋白作为衔接蛋白，能招募E3连接酶，介导受体泛素化。泛素化受体内吞进入早期内涵体，部分经去泛素化恢复至膜上，使受体复敏；另一部分受体通过ESCRT途径进入溶酶体降解，使受体下调[3,5]。3种阿片受体亚型发生的泛素化修饰方式各有不同，分析其对阿片受体功能的调控对阐明阿片类物质的耐受和依赖具有重要意义。

2.1 泛素化对μ-阿片受体转运的调节作用生理状态下，μ-阿片受体(μ-opioid receptor，MOR)有低水平的泛素化，在选择性MOR激动剂DAMGO(D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol-enkephalin)作用数分钟后，MOR泛素化水平上调，1 h达到峰值，持续约2 h[24]。MOR的赖氨酸残基位于胞内一环(K94, K96)、二环(K170, K181)、三环(K256, K265, K267)及C端(K334)。Hislop等[25]发现与MOR内吞密切相关的泛素化修饰位点为MOR胞内一环的K94和K96，并且该两位点也是MOR泛素化的主要位点，突变K94和 K96后，配体诱导的MOR泛素化水平明显降低。MOR泛素化调控离不开胞内信号分子的参与，如β-拘留蛋白和E3连接酶等。用小鼠胚胎成纤维细胞进行β-拘留蛋白-1/2双敲除，或β-拘留蛋白-1或2单敲除，再进行MOR稳定表达后分别瞬时转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)-β-拘留蛋白-1或GFP-β-拘留蛋白-2。研究发现，虽然DAMGO 能同时诱导MOR招募β-拘留蛋白-1和2，但是仅在β-拘留蛋白-1敲除后，DAMGO诱导的MOR泛素化消失，提示DAMGO诱导的MOR泛素化依赖于β-拘留蛋白-1。吗啡作用后，仅诱导MOR招募β-拘留蛋白-2，MOR出现内吞但没有泛素化，进一步说明MOR的泛素化与受体招募β-拘留蛋白-1密切相关。β-拘留蛋白-1可能是E3连接酶的衔接蛋白。进一步研究发现，MOR同β-拘留蛋白-1的特异性相互作用有助于受体的脱磷酸化，这对于受体的复敏具有重要意义[24,26]。在β-拘留蛋白-2基因敲除的小鼠，与野生型相比，吗啡镇痛作用增强且耐受减弱，而其他阿片类药物如埃托啡、芬太尼和美沙酮等没有明显差别。进一步用整体动物说明吗啡激动MOR后不能招募β-拘留蛋白-1，受体不易复敏，因而较其他阿片类药物容易形成耐受[27-28]。Smurf2属于HECT E3连接酶，Smurf2定点突变或用小干扰RNA(siRNA)干扰Smurf2表达后，都能抑制激动剂诱导的MOR内吞；特异性地干扰Smurf2的催化活性，也能明显减弱脑啡肽类似物D-Ala2, D-Leu5脑啡肽(DADLE)诱导的MOR泛素化，表明Smurf2是MOR泛素化的主要连接酶[29]。此外，果蝇SINA基因同系物(seven in absentia homologue, SIAH)分为SIAH1和SIAH2两种，也是常见的E3连接酶，其羧基端与MOR胞内二环存在相互作用，短截RING finger区使其连接酶活性缺失后，对基础水平或配体诱导的MOR泛素化均无影响[30]，提示SIAH1和SIAH2不是参与MOR泛素化的主要连接酶。HEK293细胞受体激活后，胞膜上β-拘留蛋白-2-GFP和Smurf2-GFP的荧光强度迅速增加，且β-拘留蛋白-2-GFP先于Smurf2-GFP出现在膜上；体外实验也证实Smurf2与β-拘留蛋白-2存在相互作用[29]。因此，β-拘留蛋白-2可能作为E3连接酶的衔接蛋白，招募Smurf2至MOR附近。这与之前认为β-拘留蛋白-1为E3连接酶的衔接蛋白有所矛盾[25]，原因可能在于两者所用细胞遗传背景有差别，后者在HEK293细胞只观察了β-拘留蛋白-2与Smurf2对MOR泛素化的作用，不能排除β-拘留蛋白-1也发挥作用。另有研究发现，突变MOR磷酸化位点(F-MOR 375AAANA379)，能阻断配体诱导的MOR泛素化[29]，提示MOR的泛素化也依赖于受体磷酸化，该部位的磷酸化也是招募β-拘留蛋白所必需。但是MOR磷酸化对泛素化调节的具体机制尚需进一步研究。与β2AR和CXCR4等典型的GPCR不同，MOR泛素化参与受体的内吞过程。突变MOR胞内所有赖氨酸位点(MOR-0cK)，能抑制配体诱导的受体内吞；相反，将MOR突变体胞内一环的两个赖氨酸位点突变回赖氨酸，能恢复受体内吞[25]。MOR泛素化影响受体内吞的机制在于，MOR泛素化能有效触发笼形小泡(clathrin-coated pit，CCP)的剪切作用，产生包含受体的内吞囊泡；干扰受体泛素化后，延迟CCP成熟，更多时间停留在笼形晶格组装完成但还未进行胞膜切割的中间阶段。进一步研究提示MOR泛素化促进的胞膜切割作用离不开CCP相关蛋白epsins[29]。epsins是包含泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motif，UIM)的蛋白家族，组装在CCP上。敲减或过表达epsins都会影响CCP的动态或者内吞功能[31]，其中siRNA干扰epsin2不影响MOR内吞，敲减epsin1则会明显抑制内吞[29]。Henry等[29]特异性敲减epsin1的UIM后，不影响其与泛素化蛋白结合，也不改变epsin1的分布及与CCP的组装，且MOR仍可以簇集到CCP，但是包含MOR的CCP在胞膜附近停留时间延长，MOR内吞被抑制，而MOR-0cK内吞不受影响，表明epsin1通过UIM识别泛素化MOR，引发包含受体的CCP内吞切割作用。内吞的MOR或恢复至膜上，或进行蛋白水解。对于某些GPCR，阻碍其泛素化有助于内吞受体恢复至膜上[32-33]，为了研究泛素化对MOR再循环的影响，Hislop等[25]突变MOR胞内一环的泛素化位点或突变MOR羧基端MRS短截体的所有泛素化位点(F-MOR△17-0cK)，不影响受体恢复至膜上；然而，短截MOR 羧基端的一段调控序列(MRS，aa381-398)后，内吞受体恢复至膜上的数量明显减少，且激动剂慢性处理后的受体下调明显增加[34]。这些结果提示，在决定内吞受体恢复至膜上还是进入溶酶体降解的过程中，MOR泛素化并未发挥重要作用，而是取决于MOR 羧基端的MRS序列。有研究证实，溶酶体阻断剂氯喹能抑制MOR的蛋白水解，而蛋白酶体抑制剂MG132不能，表明MOR的蛋白水解主要通过溶酶体(晚期内涵体)降解途径[25,30]；然而，氯喹并不影响MOR的泛素化水平[30]，提示MOR泛素化对其进入溶酶体降解不是必须的。免疫共定位实验也发现，DADLE处理90 min后在溶酶体同时检测到F-MOR△17和F-MOR△17-0cK[25]。此外，免疫印迹法检测DADLE处理后的MOR水解情况，发现F-MOR△17突变所有泛素化位点后，其受体降解无明显变化[25]，这也进一步证明MOR降解下调不依赖于泛素化，由于免疫印迹法中孵育抗体检测的是MOR的N端胞外域，表明MOR泛素化不影响其N端胞外域的水解。然而，免疫放射性配体结合实验证明，突变MOR胞内8个赖氨酸位点却能有效阻断配体诱导的受体下调；利用旋转盘共聚焦显微镜进一步观察到DADLE处理90 min后，F-MOR△17-GFP分布于内涵体的限定膜上及腔内，F-MOR△17-0cK-GFP则主要分布在内涵体的限定膜上，且在大多数内涵体腔内检测不到荧光[25]，提示MOR泛素化能促进受体由内涵体膜进入内涵体腔内，降解受体跨膜区，导致放射性配体结合位点下调。综上结果表明，MOR泛素化不影响其N端胞外域的水解及其向溶酶体的运输，但影响其由内涵体膜进入内涵体腔内降解受体跨膜区的过程。

2.2 泛素化对κ-阿片受体转运的调节作用配体诱导的κ-阿片受体(κ-opioid receptor，KOR)调控过程具有较大的种属差异[35]，其中对人源KOR(hKOR)研究相对较多。hKOR含有10个赖氨酸残基，分布于胞内一环(K89, K91)、胞内二环(K165, K174, K176)、胞内三环(K254, K265)及羧基端(K338, K349, K378)。与MOR不同，hKOR泛素化位点主要位于羧基端K338, K349和K378[36]。采用瞬转野生型HA-Ub、突变体HA-Ub-K63R和突变体HA-Ub-K48R的细胞研究发现，只有瞬转HAk-Ub-K63R时，hKOR泛素化水平降低，同时激动剂强啡肽A(dynorphin A，Dyn A)诱导的hKOR下调减弱，提示hKOR泛素化连接方式主要是K63-多泛素化[36]。目前，KOR泛素化的主要E3连接酶尚未明确。配体诱导的hKOR泛素化依赖于受体磷酸化。研究发现，定点干扰GRK2活性或突变KOR磷酸化位点能显著降低受体磷酸化水平；β-拘留蛋白-1(319-418)短截体不与受体结合，且明显抑制配体诱导的KOR内吞[37]。瞬时转染HA-Ub和突变体GRK2-K220R或β-拘留蛋白-1(319-418)至CHO-FLAG-hKOR细胞，在不影响hKOR基础水平的泛素化的情况下，Dyn A诱导的hKOR泛素化显著降低；突变hKOR358位磷酸化位点，Dyn A诱导的hKOR泛素化也明显下降[36]。以上研究结果表明，hKOR的泛素化与受体磷酸化及β-拘留蛋白的作用密切相关，可能原因在于突变受体磷酸化位点后，不能招募β-拘留蛋白，而β-拘留蛋白参与介导了受体的泛素化。hKOR泛素化主要影响受体下调，对受体内吞再循环影响不明显。Li等[36]将hKOR胞内10个赖氨酸突变成精氨酸(CHO-FLAG-hKOR变成CHO-FLAG-hKOR-10KR)后，KOR的泛素化显著降低，但不影响受体与配体的亲和力、配体诱导的受体脱敏及受体与G蛋白的偶联过程。与野生型hKOR相比，KOR激动剂U-50488 H诱导的hKOR-10KR突变体内吞没有变化；去除U-50488 H后，hKOR突变体恢复到膜上的速率也没有变化，提示hKOR的泛素化对受体内吞及再循环没有影响。然而，hKOR泛素化参与调控受体下调，Dyn A作用于hKOR-10KR突变体后，受体的泛素化消失，同时hKOR的下调减弱[36]。KOR的内吞运输由两种竞争机制调节：恢复到膜上的再循环信号通路与受体下调的信号通路。以上研究说明，配体诱导的hKOR泛素化主要参与受体下调的信号通路，促进内吞受体进入溶酶体降解。另外，有研究发现，瞬转突变体Rab5A-N133I和Rab7-N125I能够显著降低U-50488 H诱导的hKOR下调，其中Rab5主要参与早期内涵体转运及内吞囊泡与内涵体的融合，Rab7涉及从早期内涵体到晚期内涵体或晚期内涵体到溶酶体的胞膜转运，表明Rab5和Rab7与U-50488 H诱导的hKOR下调密切相关[38]。

2.3 泛素化对δ-阿片受体转运的调节作用与MOR及KOR不同，δ-阿片受体(δ-opioid receptor，DOR)的泛素化水平对受体激活后的内吞及进入溶酶体无明显影响。研究发现，DADLE作用于DOR数分钟后，DOR泛素化显著上调[39]。DOR胞内8个赖氨酸突变成精氨酸(DOR-0cK)后，受体泛素化明显下降，但配体诱导的DOR-0cK内吞与野生型DOR基本一致，且DOR-0cK蛋白水解的速率和程度与野生型DOR相当，表明DOR内吞及水解下调与受体的泛素化关系不大[22]。用LAMP1标记晚期内涵体/溶酶体膜后观察内吞DOR的定位情况，发现DADLE处理几分钟内，在早期内涵体观察到DOR和DOR-0cK；处理60 min后，DOR和DOR-0cK与LAMP1出现共定位[22]，以上结果说明干扰DOR泛素化不影响其进入溶酶体。进一步研究发现，DOR泛素化促进受体进入多泡体的管腔囊泡及在溶酶体中的降解。干扰DOR的 E3连接酶AIP4活性或突变DOR泛素化位点，均影响DOR胞内结构域的降解，但对胞外域水解无影响[40]。早期认为DOR水解下调与DOR泛素化无关，是由于检测的是DOR胞外域的水解情况。综上结果表明，DOR泛素化不影响受体进入ESCRT途径，但影响受体后续的降解过程。DOR的泛素化由HECT E3连接酶AIP4介导。RNA干扰或定点突变AIP4，都明显抑制DOR胞内域降解，而灭活其他E3连接酶如v-Cbl, Mdm2和Nedd4对DOR胞内域降解几乎没有影响[40]。DOR进入溶酶体的降解受泛素化和去泛素化双重调节，STAM的SH3结构域相关分子(associated molecule with the SH3 domain of STAM，AMSH)和泛素特异性加工蛋白酶Y (ubiquitin-specific processing protease Y，UBPY)是定位在包含内吞DOR的晚期内涵体/溶酶体膜上的两种去泛素化酶，敲除AMSH或UBPY对DOR降解的抑制程度与灭活AIP4引起受体降解的程度相当；同时敲除两种去泛素化酶后抑制作用并未增强，提示AMSH和UBPY在DOR运输过程不同阶段发挥作用[39]。DOR通过泛素化依赖性和非泛素化依赖性机制经ESCRT经典途径进入溶酶体降解。DOR内吞运输至溶酶体涉及独立的两步。第一步避免受体恢复至膜上，这一步与DOR 羧基端的序列关系密切，不依赖于泛素化，且很大程度决定了内吞受体的命运[40]。与MOR比较，DOR内吞后的运输明显不同，内吞的MOR倾向于恢复到膜上，而DOR内吞后倾向于进入溶酶体降解，使受体下调[34,41]；然而，交换MOR与DOR的羧基端后，MOR嵌合体下调增加，DOR嵌合体的下调受到抑制[41]，提示DOR羧基端特异性存在某种能控制内吞受体运输到溶酶体的信号，而这种信号不存在于MOR 羧基端。进一步研究发现，G-蛋白偶联受体相关分拣蛋白(G-protein-coupled receptor associated sorting proteins，GASP)能特异性地结合到非泛素化的DOR羧基端，调控DOR进入晚期内涵体，有助于受体降解；用GASP的羧基端片段(cGASP)干扰内源性GASP与DOR间的相互作用，DOR进入溶酶体受到抑制[42]。第二步是指内吞的DOR由有限的内涵体胞膜经多泡体(multivesicular body，MVB)定位到管腔囊泡，以ESCRT依赖性途径进入溶酶体降解，受体泛素化在这一步不是必须的。DOR泛素化能促进受体转移到MVB的管腔囊泡中，有助于受体胞内结构域的降解，干扰DOR泛素化或阻碍MVB形成，对受体胞外域的降解无影响[40]。尽管DOR内吞运输不依赖于受体的泛素化，但其降解需要HRS和VPS4的参与。研究表明，VPS蛋白如HRS, VPS4和Tsg101定位在内涵体膜上，密切参与泛素化底物进入溶酶体的ESCRT途径，定点突变HRS或VPS4会明显抑制DOR降解，但缺失Tsg101对DOR降解没有明显影响，提示DOR降解需要HRS和VPS4的参与，不需要Tsg101的参与[43]。

3 结语

配体作用于阿片受体后，受体与G蛋白解偶联并发生磷酸化、泛素化，进一步受体出现内吞和(或)下调，这些动态变化能够调控受体的数量及活性，使阿片受体不会被过度激活，阿片受体的泛素化能增强蛋白间的相互作用，招募胞内蛋白至受体附近，调节受体信号转导的持续时间和强度。阿片受体的泛素化机制及其对受体转运功能的影响归纳如下：① Smurf2是MOR泛素化的主要连接酶，DOR泛素化由AIP4介导，KOR的E3连接酶还不明确。② MOR和KOR的泛素化与受体磷酸化密切相关，突变磷酸化位点或者干扰磷酸化激酶如GRK2，均会抑制受体的泛素化，而DOR的泛素化和磷酸化的关系尚不明确。③ 与许多典型GPCR一样，KOR, DOR泛素化不参与受体内吞，但MOR例外。④ 内吞的阿片受体能否恢复至膜上，很大程度取决于受体羧基端的氨基酸序列，但缺失羧基端的受体仍能恢复至膜上，表明可能存在其他机制参与调节内吞受体的再循环。⑤ 内吞的MOR和DOR经ESCRT机制进入溶酶体的过程中，泛素化不影响其向溶酶体的运输及N端胞外域的水解，主要影响胞内域或跨膜区的降解，KOR泛素化参与调控受体下调，具体机制有待阐明。近年来，对阿片受体泛素化参与其信号转导的研究越来越深入，但仍有许多问题尚需进一步阐明。去泛素化酶是参与调节受体泛素化的一类重要蛋白水解酶，目前研究相对较少。有文献报道，PAR2的去泛素化发生在早期内涵体和溶酶体之间，参与的去泛素化酶是AMSH 和UBPY，siRNA干扰去泛素化酶，会影响PAR2运输至溶酶体降解[18]。然而，阿片受体的去泛素化酶在什么部位发生作用，缺失去泛素化酶是否直接影响受体降解、复敏，这些问题都有待于进一步研究。此外，某些去泛素化酶与E3连接酶形成复合物，调节E3酶活性和稳定性，更为泛素化依赖性的蛋白运输调控过程增添了复杂性[44]。总之，泛素化作为阿片受体的一种重要修饰方式，对受体内吞运输及信号传导发挥重要的作用，进一步研究阿片受体泛素化修饰对受体激活介导的生理病理变化的影响，对于阐明阿片耐受和依赖机制有一定的指导意义。

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Mechanism of opioid receptor ubiquitination and its effecton receptor function

JIANG Jie-bing1,2, ZHOU Pei-lan2, ZHENG Zhi-bing1,2, SU Rui-bin1,2

(1.PharmaceuticalCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.StateKeyLaboratoryofToxicologyandMedicalCountermeasures,InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

Opioid receptors, as an important member of G protein coupled receptors (GPCR), are the binding targets of endogenous opioid peptides and exogenous opiates. The activation of opioid receptors influences the nervous system, immune physiology and endocrine system. However, prolonged activation of opioid receptors is likely to produce opioid tolerance, leading to opioid addiction. Receptor endocytosis and sorting into the recycling pathway contribute to recovery of cellular opioid responsiveness. Recent studies have revealed that GPCR can be modulated by ubiquitination which plays a unique roles in governing GPCR trafficking. Moreover, ubiquitination of the opioid receptors (μ, κ and δ) is increased after stimulation of most opioid agonists. Mutation of the ubiquitin sites affects the internalization and degradation of opioid receptors, which contributes to changes in signal pathways and regulation of opioid receptors. In this paper, ubiquitination of opioid receptors and the fundamental role of ubiquitination in trafficking of opioid receptors are reviewed.Key words: ubiquitination; opioid receptor; G protein-coupled receptors; lysosome

SU Rui-bin, E-mail: ruibinsu@126. com; ZHOU Pei-lan, E-mail: zhoupeilan0502@sina.com

国家自然科学基金(81473194); 国家自然科学基金(30901799); 北京市自然科学基金(7092078)；国家科技重大专项(2012ZX09301003-003)

江洁冰(1990-)，女，硕士研究生，Tel: (010)66874604，E-mail: xiaoya.248@163.com; 苏瑞斌(1973-)，男，研究员，博士生导师，主要从事神经精神药理学研究。

苏瑞斌，E-mail: ruibinsu@126. com，Tel: (010)66931607; 周培岚，E-mail: zhoupeilan0502@sina.com, Tel: (010)66931621

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China (30901799); National Natural Science Foundation of China(81473194); Natural Science Foundation of Beijing City(7092078); and National Science and Technology Major Project of China (2012ZX09301003-003)

2014-10-10 接受日期: 2015-03-02)

Q26,R964

A

1000-3002(2015)02-0302-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.019

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