华辰凤, 杨 嵘, 刘羽欣, 黄丽娜, 张 丽, 张添光, 田冬冬, 赵 君, 赵增明, 王以美, 彭双清

(军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心, 北京 100071)

促性腺激素释放激素在雌二醇诱导的大鼠青春期启动提前中的作用

华辰凤, 杨 嵘, 刘羽欣, 黄丽娜, 张 丽, 张添光, 田冬冬, 赵 君, 赵增明, 王以美, 彭双清

(军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心, 北京 100071)

目的 探讨促性腺激素释放激素(GnRH)在雌二醇(E2)诱导大鼠青春期启动提前中的作用。方法 18日龄雌性SD大鼠分别经口给予玉米油和E250 μg·kg-1，连续给药5 d。观察大鼠阴道开口时间及卵巢组织变化；Western蛋白印迹法检测下丘脑的GnRH、G蛋白偶联受体54(GPR54)和磷脂酶C(PLC)蛋白表达水平。结果 与玉米油对照组相比，E2组大鼠阴道开口时间显著提前约12.2 d(P<0.01)。卵巢组织切片可见黄体，且下丘脑GnRH, GPR54和PLC蛋白表达水平分别增加47%, 55%和56%(P<0.05)。结论 E2诱发的大鼠青春期启动时间提前可能与调节下丘脑GnRH, GPR54和PLC表达相关。

雌二醇; 青春, 早熟; 促性腺激素释放激素

雌二醇(estradiol，E2)是由卵巢和大脑神经元合成分泌的性激素，参与促进女性内外生殖器官发育和维持女性性功能及第二性征。调查发现，畜禽产品中检出的 E2以及类雌激素样物质被认为可能是引起婴幼儿性早熟的一个原因，但具体机制尚不明确。青春期发育启动受下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)调控，其中下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)脉冲式释放，是青春期启动的分子阀门[1-2]。研究发现，下丘脑G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptor 54，GPR54)可激活细胞内第二信使磷脂酶C(phospholipase C，PLC)，调节GnRH的表达，被认为是青春期发育启动的关键靶点[3]。本研究旨在探讨GnRH, GPR54和PLC在E2诱导大鼠青春期启动提前中的作用，为探讨类雌激素样作用的外源性物质引起性早熟机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

市售精制玉米油购自北京华联超市，金龙鱼河北省秦皇岛金海食品工业有限公司生产；17β-E2购自美国Cayman公司；β肌动蛋白、GnRHⅠ和GPR54抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；PLC抗体购自英国Abcam公司；WIP组织细胞裂解液(tissue and cell lysis solution for Western blotting and immunoprecipitation)购自北京赛驰生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SuperECL Plus 超敏发光液、脱脂奶粉和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体均购自北京普利莱基因技术有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidine difluoride，PVDF) 膜购自美国Millipore公司；X线胶片购自美国Kodak公司。TBST缓冲液(mmol·L-1，pH 7.4～7.5)：Tris-HCl 20， NaCl 140；0.05%Tween-20。CR3i型低温高速冷冻离心机和MK3型多功能酶标仪(上海Thermo公司)；BT224S型电子天平(德国Sartorius公司)；CKX41型倒置显微镜(美国ABI公司)。

1.2 动物SPF级SD未孕大鼠，雌、雄各20只，体质量250～300 g(雌)、300～350 g(雄)，由军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK-(军)2007-004。饲养于军事医学科学院疾病预防控制所SPF级大鼠动物房，恒温(22～26℃)、恒湿(40%～70%)，自由摄食饮水。实验方法均遵循NIH制定的关于动物饲养和使用的规定并得到军事医学科学院动物饲养和使用管理委员会的批准。

1.3 合笼动物分组及给药雌雄大鼠1∶1合笼交配，自由饮食。孕鼠单笼饲养，产后，选用雌性仔鼠，由亲鼠自养。雌仔鼠在出生18日龄(postnatal day 18，PND18)时予以标记编号，按照窝别区组及体质量随机分组分为玉米油对照组和E2处理组(E2组)，每组8只。玉米油对照组和E2组大鼠灌胃容量为2.5 mL·kg-1，每天1次，连续5 d[4-5]。PND21仔鼠断奶。

1.4 一般指标观察自给药开始当日，每日称量并记录大鼠体质量，观察大鼠死亡率、发病率和一般的临床表现并及时记录异常情况，观察项目主要包括：行为、皮肤、毛发、眼睛、黏膜、分泌物、排泄物和自主活动(如流泪、毛发直立、瞳孔大小、异常的呼吸模式)等，持续观察至大鼠处死当日。

1.5 观察大鼠阴道开口时间自给药开始当日，每日检查阴道开口，记录阴道开口时间，观察至大鼠处死。

1.6 脏器系数测定及卵巢组织学检查大鼠于末次染毒后48 h颈椎脱臼处死，取下丘脑、卵巢和子宫。卵巢称重后用10%甲醛固定；下丘脑称重后置于冻存管内，迅速置液氮中冷冻，然后置于-80℃冰箱中备用。脏器系数=脏器质量(mg)/体质量(g)。卵巢组织固定，24 h后修片、脱水、石蜡包埋，沿卵巢组织长轴切片，HE染色，观察各期卵泡形态并计算每侧黄体出现率。

1.7 Western蛋白印迹法检测下丘脑组织匀浆中GnRH, GPR54和PLC蛋白的表达水平将冻存于-80℃的各组大鼠下丘脑取出，按每 20 mg组织加100～200 μL的比例加入WIP。用组织细胞匀浆器匀浆直至蛋白充分裂解。冰浴30 min(每10 min，涡旋振荡1次，每次10 s)后，4℃离心(14 000×g 5 min)，取上清，即得到相应蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白定量，电泳中每份样品上样量为20 μg。转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，用5%脱脂奶粉稀释一抗孵育PVDF膜，保持4℃低温过夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育1.5 h，3次洗膜后，用ECL系统在X线胶片上显影。胶片扫描后，使用Image J分析软件对全部实验条带进行灰度分析，以β肌动蛋白为内参，分析目标蛋白的表达， 以目标蛋白条带积分吸光度值与对应样品的β肌动蛋白积分吸光度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 雌二醇对大鼠一般状态的影响整个实验过程中，两组大鼠均无异常死亡，进食及饮水均未见异常，且生长状况良好。给药期间，随着饲养时间的延长，大鼠体质量逐渐增加，两组组间体质量随时间变化均无统计学差异(图1)。

2.2 雌二醇对雌性大鼠阴道开口时间的影响大鼠自给药到处死，仅观察到E2组大鼠阴道开口，而玉米油对照组大鼠观察至实验结束时阴道仍未开口。此外，参照本实验室前期相关研究结果，玉米油处理组大鼠阴道开口时间为(34.7±1.0)日龄[5]，E2组大鼠阴道开口时间为〔(22.5±0.5)日龄〕，与玉米油处理组提前约12.2 d(n=8，P<0.01)。

2.3 雌二醇对雌性大鼠卵巢和子宫脏器系数的影响如表1所示，与玉米油对照组相比，E2组子宫系数显著增加153%(P<0.05)；而玉米油组卵巢系数无显著性差异。

Tab.1 Effect of E2on reproductive organs of female rats

GroupIndicesoforgan/mg·g-1OvaryUterusCornoil0．49±0．060．38±0．04E250μg·kg-10．47±0．020．96±0．17∗

2.4 雌二醇对雌性大鼠卵巢组织的影响如图2所示，玉米油对照组可见各期卵泡，但未见黄体(图2A)；而E2组不仅可见各期卵泡，而且可见黄体(图2B)。E2组每张组织切片可见黄体(1.9±0.8)个，与玉米油对照组相比明显增加(P<0.05)。

Fig.2 Histological changes of ovary treated with E2(HE ×200). A: corn oil group; B: E2group. The arrow indicates the corpus luteum.

2.5 雌二醇对雌性大鼠下丘脑组织匀浆中GnRH，GPR54和PLC蛋白表达水平的影响Western蛋白印迹(图3A)及其定量结果(图3B)显示，与玉米油对照组相比，E2组大鼠下丘脑GnRH, GPR54和PLC蛋白表达水平均显著增加，分别增加47%, 55%和56%(P<0.05)。

3 讨论

本研究结果显示，E2可使大鼠阴道开口时间显著提前，子宫系数显著增加，卵巢黄体提前生成，提示E2可诱发大鼠青春期提前启动；另外，E2可以促进大鼠下丘脑GnRH，GPR54和PLC的表达，提示下丘脑GnRH，GPR54和PLC可能参与E2诱导大鼠青春期启动提前过程中的调控。青春期启动是一个复杂的神经内分泌过程，主要由HPGA所调控。当雌性大鼠发育到一定阶段，作为HPGA启动的始动因子GnRH合成分泌开始增加，进而刺激垂体节律性的分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)来促进性腺分泌雌激素和睾酮等激素[6]，从而调节青春期发育过程中的性器官发育；其中阴道开口通常作为判断雌性大鼠青春期启动的外在标志[7]，子宫重量的增加、卵巢黄体的生成可作为青春期趋于性成熟的外在表征[8]。本研究结果发现，E2组大鼠阴道开口时间提前，这与Hilakivi-Clarke等[9]研究中E220 μg·kg-1可引起大鼠性早熟相一致；考虑到玉米油作为赋形剂可能具有雌激素作用影响大鼠青春期启动，因此，本实验室在预实验中设立了阴性对照组。预实验中，延长了玉米油对照组给药后的观察时间，发现阴性对照组与玉米油对照组大鼠阴道开口时间均约为34 d，且与文献查阅正常大鼠阴道开口时间一致，提示玉米油作为赋形剂对大鼠青春期没有明显影响。由于大鼠卵巢、子宫和阴道组织上也有丰富的雌激素受体表达，而本研究中E2组大鼠子宫重量明显增加且卵巢中发现黄体，这一结果不能证明E2对大鼠卵巢、子宫和阴道的作用是直接的还是诱发青春期启动，即通过HPGA调控阴道、子宫和卵巢发育的。但是，基于本实验室相关研究结果[5]，血清中LH与FSH显著增加，且LH与FSH的比值>1为真性性早熟，提示一定量的E2可能是大鼠青春期启动提前即HPGA提前启动的一个诱因。本研究结果显示，E2处理组中作为HPGA启动的始动因子GnRH蛋白表达水平显著增加，这提示E2诱发青春期启动可能是通过影响下丘脑GnRH的合成和分泌来促发HPGA提前启动来完成的。近年来研究表明，E2可通过下丘脑前腹侧室旁核雌激素受体α介导kiss-1基因编码kisspeptins，参与GnRH的分泌[10]；与本研究结果E2处理组大鼠下丘脑GnRH蛋白表达水平显著增加相一致。另外研究发现，kisspeptins可与GnRH神经元上的GPR54结合，激活GnRH神经元分泌GnRH，提示GPR54可能是E2诱发青春期启动提前引起GnRH分泌的一个关键[11]。GPR54作为kisspeptins的特异性受体，属于G蛋白偶联受体，根据近年来GPR54定位的研究发现，GPR54在各种组织中广泛表达，以下丘脑、胚胎和胰腺等表达最高，并且存在于下丘脑GnRH神经元上，参与GnRH的分泌[12]。因此，本研究在上述研究结果的前提下进一步探讨E2对下丘脑GPR54表达水平的影响。本研究中，E2处理组大鼠下丘脑GPR54蛋白表达水平显著增加，证实了一定剂量的E2可促进下丘脑GPR54的表达。基于本实验室前期相关研究结果，E2可引起编码kisspeptins的kiss-1 mRNA表达增加[5]，因此，笔者推测E2可能通过kiss-1神经元上的ERα受体介导kiss-1神经元编码表达kisspeptins，然后kisspeptins与GnRH神经元上的GPR54结合，激活GnRH神经元分泌GnRH[13]调节青春期启动与发育，而这可能是E2引起GnRH分泌和青春期启动的路径之一。相关研究表明，kisspeptins与GnRH神经元上的GPR54结合后，可激活 PLC，致磷脂酰肌醇积聚和Ca2+动员等一系列胞内信号转导，使GnRH表达增加[14]。本研究发现，在E2可引起下丘脑GnRH及GPR54蛋白表达水平增高的基础上，E2处理组PLC蛋白表达水平显著增加，提示E2诱发青春期提前启动过程中，可能是通过促进GPR54表达后，使PLC活化增加，进而促进GnRH表达使HPGA提前启动。可见，下丘脑神经元GPR54-PLC-GnRH在E2调控青春期启动与发育的过程中发挥着重要作用，但由于青春期的调控是一个复杂的神经内分泌网络系统，下丘脑GPR54-PLC-GnRH与E2引起青春期启动和发育过程中还有更多的作用机制和调控路径有待于进一步研究。

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(本文编辑: 乔 虹)

第七次全国毒理学大会会议通知

由中国毒理学会主办的第七次全国毒理学大会(CSOT-Ⅶ)将于2015年10月25-28日在湖北省武汉市东湖宾馆国际会议中心召开。本次大会主题：协同创新，驱动毒理学发展。大会网站http://www.chntox.org/csot7/cn/现已开通，接受网上投稿和注册。全国毒理学大会是中国毒理学领域最高层次学术盛会，此次大会将邀请国内外知名专家和学者就毒理学领域的最新研究进展、前沿理论与技术发展做大会报告，中国毒理学会热诚欢迎我国毒理学和相关领域的专家、学者、科技和教育工作者、管理人员、研究生以及相关企业工程技术人员等踊跃投稿，积极参加会议，展示学术成果。大会期间还将举办相关科技产品、试剂和仪器等毒理科技展览，欢迎生物和医药科技企业和厂家等参展。此外，还将根据广大会员对专业知识更新的需求，举办相关的新技术、新方法、新理论的继续教育培训班，邀请国内外著名毒理学专家主讲。大会征集和交流的学术论文将涵盖毒理学和相关学科领域的科研和管理等内容的研究论文，截止日期为2015年8月15日。摘要格式具体要求：① 论文摘要1000字以内(不少于600字)。② 所提交的论文摘要必须尚未在杂志上公开发表，论文摘要包括论文的题目、作者、单位和电子邮箱地址，论文摘要内容采用结构式摘要，包括目的、材料和方法、结果、结论。综述性文章摘要可按照论述式撰写。文字表达应符合科学论文一般规范要求，表达要求准确、简洁明了，真实反映研究结果。使用代号或缩写应有相关说明(保密内容由作者处理，文责自负)。联系人：孔祥颖；地址：北京市海淀区太平路27号中国毒理学会；邮编：100850电话：(010)66932387(办)；E-mail: cst@chntox.org

Role of gonadotropin-releasing hormone on advancing ratpuberty onset induced by estradiol

HUA Chen-feng, YANG Rong, LIU Yu-xin, HUANG Li-na, ZHANG Li, ZHANG Tian-guang,TIAN Dong-dong, ZHAO Jun, ZHAO Zeng-ming, WANG Yi-mei, PENG Shuang-qing

(EvaluationandResearchCentreforToxicology,InstituteofDiseasePreventionandControl,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

OBJECTIVE To investigate the role of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in estradiol(E2) induced advance of puberty onset in rats. METHODS Postnatal day 18 SD rats were given a daily intragastric administration of corn oil or E2(50 μg·kg-1) for consecutive 5 d. The day of vaginal opening (VO), pathological changes in ovary and protein expression levels of GnRH, G protein-coupled receptor 54 (GPR54) and phospholipase C (PLC) in hypothalamus were observed. RESULTS As compared to corn oil controll group, VO was advanced by about 12.2 d, corpus luteum was observed in the ovary section, and the protein expression levels of GnRH,GPR54 and PLC in hypothalamus were significantly increased by 47%, 55% and 56% in E2group, respectively. CONCLUSION E2induced onset of puberty advance may be closely related to regulation of the expression of GnRH, GPR54 and PLC in hypothalamus. Key words: estradiol; puberty, precocious; gonadotropin-releasing hormone

PENG Shuang-qing, E-mail: pengsq@hotmail.com, Tel: (010)66948462

国家自然科学基金(81172699)

华辰凤，女，硕士研究生，主要从事药物安全与食品卫生研究；彭双清(1962-)，男，研究员，博士生导师，主要从事药物安全与食品卫生研究。

彭双清, E-mail: pengsq@hotmail.com, Tel: (010)66948462

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China (81172699)

2014-11-04 接受日期: 2015-03-15)

R977.1

A

1000-3002(2015)02-0260-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.012

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