赵锡鹏, 罗 月, 董 超, 张凤梅, 凤志慧

(山东大学公共卫生学院环境与健康系, 山东 济南 250012)

丙戊酸对乳腺癌细胞放射敏感性的影响

赵锡鹏, 罗 月, 董 超, 张凤梅, 凤志慧

(山东大学公共卫生学院环境与健康系, 山东 济南 250012)

目的 探讨丙戊酸(VPA)对乳腺癌细胞MCF7放射敏感性的影响。方法 MCF7细胞用VPA临床安全剂量0.5 mmol·L-1和临界剂量1 mmol·L-1分别预处理0, 24, 48和72 h，8Gy电离辐射后6 h，免疫荧光染色法观察磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)焦点形成。对数生长期的MCF7细胞分别以VPA 0.5和1 mmol·L-1预处理72 h，4 Gy电离辐射后48 h，MTT法检测细胞存活率。MCF7细胞用VPA 0.5 mmol·L-1预处理24 h后，按照每皿接种细胞数分别给予电离辐射2 Gy(每皿500和1000)，4 Gy(每皿2000和4000)和6 Gy(每皿8000和16000)，计算克隆形成率。MCF7细胞分别用VPA 0.5和1 mmol·L-1预处理0, 24, 48和72 h，流式细胞仪检测细胞周期。结果 与正常对照组相比，单独VPA 0.5 mmol·L-1处理0, 24, 48和72 h后，γ-H2AX焦点阳性率分别为(5.3±0.6)%，(10.8±1.0)%，(12.6±0.9)%和(17.8±1.1)%(r=0.985,P<0.05)；VPA 1 mmol·L-1对γ-H2AX焦点形成有相同的影响趋势。单独照射组细胞核内γ-H2AX焦点阳性率为100%，其中表示DNA损伤较重的焦点较大且明亮的B类细胞所占比例为(16.5±1.8)%；与单独照射组相比，VPA 0.5 mmol·L-1预处理0, 24, 48和72 h后，B类细胞所占比例分别为(16.5±1.8)%，(28.9±1.0)%，(58.0±2.0)%和(70.8±0.9)%(r=0.986,P<0.05)；VPA 1 mmol·L-1对辐射诱导的γ-H2AX焦点形成的影响有相同趋势。MTT和细胞克隆形成实验结果显示，与正常对照组相比，单独给予VPA 0.5 mmol·L-1可显著降低细胞克隆形成率(P<0.05)；与单独照射组相比，VPA预处理后接受电离辐射能显著降低细胞存活率(P<0.05)和细胞克隆形成率(P<0.05)；VPA 0.5和1 mmol·L-1对细胞周期影响均无统计学差异。结论 临床安全剂量和临界剂量VPA对肿瘤细胞具有放射增敏作用，且对肿瘤细胞生长具有抑制作用，其机制与增加电离辐射所致的DNA双链断裂损伤的蓄积有关。

丙戊酸; 乳腺癌; DNA损伤; 放射增敏; 细胞周期

丙戊酸(valproic acid, VPA)在临床上被广泛应用于治疗癫痫病和其他痉挛性疾病，是具代表性的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂之一[1]。近年来研究发现，VPA、伏立诺他、曲古抑菌素A和苯异羟肟酸-24781等新型HDAC抑制剂均可以造成DNA双链断裂增加[2]，例如苯异羟肟酸-24781能显著增加HCT116, NCI-H460和A549细胞对电离辐射(ionizing radiation, IR)的敏感性，使其细胞克隆形成率明显下降[3]；伏立诺他可抑制人卵巢癌紫杉醇耐药细胞OC3/P的存活，对肝癌细胞具有杀伤作用[4-5]。已有研究报道，VPA 1 mmol·L-1可增强乳腺癌细胞对IR的敏感性[6]，但VPA治疗癫痫病的正常血药浓度为50～120 mg·L-1(相当于0.3～0.8 mmol·L-1)。VPA在治疗癫痫病的安全血药剂量或临界剂量内对乳腺癌细胞放射敏感性的影响尚未见报道。故本研究选择VPA在癫痫治疗的临床安全剂量0.5 mmol·L-1和临界剂量1 mmol·L-1，探讨其对乳腺癌细胞放射敏感性的影响，为应用于肿瘤放射治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂MCF7细胞购自美国ATCC公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；高糖DMEM购自上海立菲生物技术有限公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝生物科技有限公司；VPA，MTT 和DAPI均购自美国Sigma公司；抗磷酸化的组蛋白H2AX(γ-H2AX)抗体购自美国Millipore公司；荧光标记羊抗鼠二抗购自美国Invitrogen公司。

1.2 仪器设备CO2细胞培养箱，北京博奥恒信生物科技有限公司；超净工作台，济南杰康净化设备厂；8孔细胞培养板，美国BD公司；普通光学倒置显微镜、荧光显微镜，日本Olympus公司；Primus S型医用直线加速器，德国西门子公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司；高速离心机，美国Thermo公司；M200PRO酶标仪，瑞士Tecan公司。

1.3 细胞培养MCF7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中，培养至80%～90%融合度时，用0.25%含EDTA胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.4 电离辐射将受试细胞置于医用直线加速器上接受IR处理。细胞照射的条件：6 MV X射线，吸收剂量率2.33 Gy·min-1；射野为40 cm×40 cm。根据吸收剂量率，计算IR剂量2，4，6和8 Gy照射细胞所需的时间分别为0.86，1.72，2.58和3.43 min。

1.5 免疫荧光染色实验观察焦点形成MCF7细胞消化后接种于4块8孔细胞培养板中，用VPA 0.5和1 mmol·L-1预处理细胞24, 48和72 h，取其中2块板接受8 Gy的IR照射，另2块板无IR处理，均继续培养6 h后，PBS洗3次，室温下用4%甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100处理10 min, PBS洗3次，10%血清37℃封闭30 min。用含1%BSA-0.1%Triton X-100的PBS按1∶500稀释γ-H2AX一抗，4℃孵育过夜后，按1∶300稀释羊抗鼠荧光标记二抗，室温下避光封闭40 min。PBS洗后，用DAPI(0.1 mg·L-1)染色2 min，用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察焦点形成情况。焦点形成的判定标准：① 无IR暴露条件下，以细胞核内焦点数>10者定为阳性细胞；② IR暴露条件下，因受照射细胞均有大量γ-H2AX焦点形成，根据焦点的形态不同将所观察的细胞分成 A类和B类细胞，A类细胞内焦点较小而且亮度较弱， B类细胞内焦点较大且明亮。分别计数这两类细胞，进行统计学分析。

1.6 MTT法检测MCF7细胞存活取MCF7细胞制备细胞悬液，每孔接种6000个细胞于96孔板，每孔100 μL。培养过夜，除对照组外，分别用VPA 0.5和1 mmol·L-1预处理72 h，每个梯度设置6复孔，同时设调零孔和对照孔。IR 4 Gy组和IR+VPA 0.5和1 mmol·L-1组给予4 Gy的IR，照射后44 h，每孔加入含20 μL MTT的培养液120 μL，继续培养4 h后，每孔加入150 μL DMSO，充分振摇10 min，酶标仪在波长490 nm处检测吸光度值(A490 nm)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=实验组A490 nm/对照组A490 nm×100%。

1.7 细胞克隆形成实验取MCF7细胞消化制备细胞悬液接种至60 mm培养皿中培养。对照组：按每皿500和1000个细胞接种于60 mm培养皿中培养；VPA 0.5 mmol·L-1组：按每皿500和1000个细胞接种于60 mm培养皿中过夜，更换含VPA 0.5 mmol·L-1继续培养24 h后换为新鲜培养液；IR 2, 4, 6 Gy组和IR+VPA 0.5 mmol·L-1组：按每皿500，1000，2000，4000，8000和16 000个细胞接种于60 mm培养皿中，过夜，IR+VPA 0.5 mmol·L-1组更换为含VPA 0.5 mmol·L-1继续培养24 h，随后两组细胞分别给予3个剂量IR照射：2 Gy(每皿500，1000个细胞)、4 Gy(每皿2000，4000个细胞)和6 Gy(每皿8000，16 000个细胞)。上述4个处理组均同时设3个平行对照。培养15 d，当培养皿中出现肉眼可见克隆时，用20%乙醇溶解稀释甲素(结晶紫)至0.1%，用该甲紫溶液固定并染色细胞克隆30 min后，用去离子水冲洗3次，置空气中干燥。倒置显微镜下计数≥50个细胞的克隆数，结果取平均值，并计算克隆形成率。克隆形成率(%)=每皿克隆数/每皿接种细胞数×100%。

1.8 流式细胞仪检测细胞周期将细胞种于p60培养皿中过夜，除对照组外，分别给予VPA 0.5和1 mmol·L-1处理24，48和72 h，用胰酶消化和收集各组细胞，转移至15 mL离心管中，1000×g离心5 min，弃上清，加入约5 mL PBS，混匀后1000×g离心5 min，弃上清。加70%冷乙醇，置于-20℃过夜后1000×g离心5 min,弃上清，PBS洗1次，再次1000×g离心5 min，弃上清。室温下PI染液染色30 min，用流式细胞仪对细胞周期进行检测。

2 结果

2.1 VPA对 IR诱导的γ-H2AX焦点形成的影响如图1所示，VPA 0.5 mmol·L-1处理MCF7细胞24 h后，与正常对照组(图1A1和1B1)相比，γ-H2AX焦点数目明显增加(图1A2和1B2)，焦点阳性率由5.3%显著增加至10.8%(图1C，P<0.05)；VPA处理48(图1C)和72 h(图1A3，1B3和1C)后，与正常对照组相比焦点阳性率进一步增加至12.6%(图1C，P<0.01)和17.8%(图1C，P<0.01)。即随着处理时间延长，γ-H2AX焦点阳性率逐渐增高，呈时间依赖性(r=0.985, P<0.05)(图1C)。VPA 1 mmol·L-1处理组γ-H2AX焦点阳性率变化趋势与0.5 mmol·L-1相同，但比0.5 mmol·L-1组变化更为明显(图1C)。

单独IR处理6 h后组(图2A1和2B1)中, A类和B类细胞所占比例分别为83.5%和16.5%(图2C)； VPA 0.5 mmol·L-1预处理24 h后(图2A2和2B2)，与单独IR组相比，A类细胞所占比例下降至71.1%(图2C，P<0.05)，而B类细胞则显著增加至28.9%(图2C，P<0.05)；VPA预处理48(图2C)和72 h(图2A3, 2B3和2C)后, A类细胞比例进一步降低至42.0%和29.2%(图2C,P<0.01)，而B类细胞比例则相应增加至58.0%和70.8%(图2C，P<0.01)。即与单独IR组相比，随VPA预处理时间延长， A类细胞比例逐渐减少，而B类细胞比例逐渐增加，呈时间依赖性(r=0.986,P<0.05)。VPA 1 mmol·L-1预处理与0.5 mmol·L-1组有相同的变化趋势(图2C和2D)。

2.2 VPA对MCF7细胞存活率和克隆形成率的影响MTT结果显示(图3A1)，与正常对照组比较， VPA 0.5和1 mmol·L-1处理细胞72 h对细胞存活率无明显影响。细胞克隆形成实验显示(图3A2)，与正常对照组比较，VPA 0.5 mmol·L-1可显著地降低细胞的克隆形成率(P<0.05)。提示VPA本身可影响细胞的生长。

为排除VPA本身对细胞生长的影响，在VPA对细胞放射敏感性影响实验中，以单独VPA处理细胞时的存活率(或克隆形成率)为基准，对MTT和细胞克隆形成实验所得的VPA联合IR的各组数据进行校正(图3B1和3B2)。MTT结果显示(图3B1)，与单独4Gy组比较，VPA 0.5和1 mmol·L-1预处理细胞72 h，再经4 Gy照射后48 h，细胞存活率显著降低(P<0.05)。细胞克隆形成实验显示(图3B2)，与单独IR组比较，IR+VPA 0.5 mmol·L-1组可显著地降低细胞的克隆形成率(P<0.05)，尤其VPA与4 Gy联合组对细胞毒性作用最为明显(P<0.01)，这一结果与MTT实验结果一致。

2.3 VPA对MCF7细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示，与正常组相比，VPA 0.5和1 mmol·L-1处理MCF7细胞24，48和72 h后对细胞周期G1, S和G2/M期影响无统计学差异(图4)。

3 讨论

本研究结果显示，VPA在治疗癫痫病的安全血药剂量及临界剂量下均可致MCF7细胞内DNA双链断裂增加，且在上述剂量和作用时间条件下均未引起细胞周期改变。VPA预处理后显著增加了IR诱导DNA双链断裂损伤的蓄积，抑制DNA损伤的修复及提高了IR对MCF7细胞的杀伤能力,提示VPA在安全血药剂量范围内能够增加MCF7细胞对放射的敏感性，即具有放射增敏作用。本研究中细胞克隆形成实验观察到VPA可降低MCF7细胞克隆形成率，但MTT实验并未观察到VPA对MCF7细胞显著的毒性作用，可能是MTT测定的是在相对较短时间内(1周内)的细胞毒性反应，而细胞克隆形成实验则反映的是相对较长时间内(2～3周后)的细胞毒性反应，也说明单独VPA对细胞的毒性作用可能具有一定的延迟性。此外，通过以单独VPA处理细胞时的生存分数为基准校正了VPA联合IR的数据，排除了VPA本身所产生的毒性对细胞放射增敏性的贡献，也表明本研究结果具有可信性。近年来研究发现，VPA作为新型HDAC抑制剂可明显增加其他多种肿瘤细胞的放射敏感性，VPA(或丙戊酸钠)高浓度(1.5～8 mmol·L-1)预处理后给予IR比单纯给予IR能明显降低前列腺癌细胞DU-145、人红白血病细胞株K562细胞、胃癌SGC-7901细胞和人脑胶质瘤细胞系SHG-44等多种肿瘤细胞的存活率[7-9]。Sha等[10]研究发现，高浓度(5 mmol·L-1)VPA能使CHO33细胞DNA双链断裂增加、核内γ-H2AX焦点形成蓄积显著增加。Kachhap等[7]研究还发现，高浓度的VPA (1.5 mmol·L-1)预处理前列腺DU-145肿瘤细胞后给予IR比单独IR处理组能造成更多的γ-H2AX焦点形成在核内蓄积，这一报道与本研究的结果相一致。与其他类型的HDAC抑制剂相比，VPA在体内稳定性好，虽然曲古抑菌素A等是天然强效的HDAC抑制剂，但由于在体内的不稳定性而导致其失去临床应用的可能。此外，VPA分子量小较容易通过血-脑脊液屏障，且具有显著的神经元保护作用。因此，良好的生物利用度和低毒特性是对VPA放射增敏研究的明显优势。本研究结果表明，VPA在其临床安全血药剂量即显示出对乳腺癌细胞明显的放射增敏作用，相比其他HDAC抑制剂更具有临床应用价值。关于HDAC抑制剂对肿瘤细胞放射增敏的作用机制，现有的报道提出与细胞周期阻滞(G1期阻滞)的启动、DNA合成被抑制、细胞凋亡和细胞自噬等机制有关[12-14]。Chen等[14]还提出，p53基因的状态等可能是导致细胞对IR处理更敏感的原因。本研究发现，VPA临床安全剂量(0.5 mmol·L-1)和安全临界剂量(1 mmol·L-1)作用24～72 h都没有引起细胞周期明显变化，但却能明显地加重IR诱导的DNA双链断裂损伤，提示在临床安全血药剂量下VPA对乳腺癌细胞的放射增敏作用与细胞周期无关。此外，本研究中所用的乳腺癌细胞MCF7是细胞凋亡相关的胱天蛋白酶3基因缺失细胞系，胱天蛋白酶3基因缺失能导致MCF7细胞对IR诱导的细胞凋亡产生耐受[15]，间接提示本研究的VPA放射增敏作用也可能与细胞凋亡机制无关。结合本研究结果推测，DNA损伤修复障碍可能是VPA诱导细胞放射增敏的关键机制之一。同源重组和非同源末端连接是修复DNA双链断裂的两种重要机制，VPA对这两种修复机制的影响尚需更深入的研究。

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(本文编辑: 乔 虹)

Effect of valproic acid on radiosensitivity to breast cancer cells

ZHAO Xi-peng, LUO Yue, DONG Chao, ZHANG Feng-mei, FENG Zhi-hui

(DepartmentofEnvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

OBJECTIVE To study the effect of valproic acid (VPA) on radiosensitivity to MCF7 breast cancer cells. METHODS MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 0, 24, 48 and 72 h respectively, irradiated with 8 Gy IR, and at 6 h post-IR, the γ-H2AX foci formation in MCF7 cells was tested by immunofluorescence assay. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 72 h, irradiated with 4 Gy IR, and at 48 h post-IR, the cell survival rate was detected by MTT assay. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 mmol·L-1for 24 h, and then irradiated according to the amount of cells: 2 Gy (500 and 1000 cells per plate), 4 Gy (2000 and 4000 cells per plate), 6 Gy (8000 and 16000 cells per plate), and the cloning efficiency was calculated. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 0, 24, 48 and 72 h respectively and the cell cycle profile was analyzed via flow cytometry. RESULTS After treatment with VPA alone for 24 h, MCF7 cells showed a significant increase in the amount of γ-H2AX foci formation(P<0.01). It was also found that VPA increased IR-induced γ-H2AX foci formation, which obviously prolonged the pretreatment time of VPA(P<0.01) in a time-dependent manner(r=0.98,P<0.05). VPA 0.5 and 1 mmol·L-1had the same effect on γ-H2AX foci formation. Furthermore, VPA was able to cause a significant decrease in IR-induced clonogenic survival but an increase in IR-induced cytotoxicity by MTT assay. Also, VPA alone decreased the plating efficiency of MCF7 cells. However, the cycle profile of MCF7 cells treated with both VPA 0.5 and 1 mmol·L-1was not changed. CONCLUSION Without affecting the cell cycle profile, both the safe and critical dose of VPA used in clinical epilepsy treatment can significantly increase the accumulation of DNA double strand breaks in the cells and sensitize the cells to IR treatment, suggesting that VPA can induce radiosensitization of breast cancer cells.Key words: valproic acid; breast cancer; DNA damage; radiosensitivity; cell cycle

FENG Zhi-hui, E-mail: fengzhihui@sdu.edu.cn, Tel: (0531)88382137

国家自然科学基金(81172527); 国家自然科学基金项目(81472800)；山东省科技发展计划(2013GGE27052)

赵锡鹏(1988-)，男，硕士研究生，主要从事DNA损伤修复的分子机制与放射毒理研究。

凤志慧，E-mail: fengzhihui@sdu.edu.cn, Tel: (0531)88382137

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China(81172527); National Natural Science Foundation of China(81472800); and Science and Technology Program of Shandong Province(2013GGE27052)

2014-05-31 接受日期: 2015-02-17)

R979.1

A

1000-3002(2015)02-0247-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.010

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