李少恒，教亚男，姚璎珈，孔 亮，陶震宇，闫宇辉，杨静娴

（辽宁中医药大学药学院药理学教研室，辽宁大连 116600）

蛇床子素对感染APP基因的神经元突触的保护作用

李少恒，教亚男，姚璎珈，孔 亮，陶震宇，闫宇辉，杨静娴

（辽宁中医药大学药学院药理学教研室，辽宁大连 116600）

中国图书分类号：R284.1；R329.25；R338.1；R745.702.2

摘要：目的 探讨蛇床子素（osthole，Ost）对感染APP（amy-loid precursor protein）基因的神经元突触的保护作用及其机制。方法 将培养的神经元分为对照组（感染GFP组）、模型组（感染APP组）和给药组（Ost＋APP组）。通过感染含有突变位点的APP基因来模拟阿尔茨海默病，CCK-8法检测神经元的存活能力，免疫荧光化学法对突触素-1（synap-sin-1，SYN）染色，ELISA法检测神经元突触内突触后膜蛋白-95（PSD-95）和突触体素（synaptophysin，SYP）蛋白的浓度，Western blot法检测Aβ1－42、钙调蛋白激酶激酶2（calci-um／calmodulin-dependent protein kinase kinase 2，CAMKK2）、磷酸化单磷酸腺苷活化蛋白激酶α1（5’-adenosine mono-phosphate-activated protein kinaseα1，p-AMPKα1）、AMPKα1的蛋白表达。结果 感染APP的神经元显现较强的APP阳性，并生成有神经毒性的Aβ1－42。与模型组比较，给药组明显增强神经细胞的存活能力，增加synapsin-1的表达量，提高PSD-95和SYP的浓度，降低CAMKK2、p-AMPKα1蛋白的表达。结论 蛇床子素对感染APP基因的神经元突触造成的损伤具有保护作用，此神经保护作用可能是与抑制CAMKK2／AMPK信号通路有关。

关键词：蛇床子素；神经元；突触；感染；阿尔茨海默病；CAMKK2／AMPK信号通路

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．024．html

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化进程的加快，其影响已经不容忽视，其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力衰退、语言以及社会适应程度的改变［1］。研究表明［2］，Aβ沉积可导致神经元突触缺失及神经功能退化，但是目前还没有明显有效的治疗手段。蛇床子素（（7-methoxy-8-isopentenoxycoumarin，C15H16O3，osthole，Ost）是从伞形科植物如独活和蛇床子等提取分离出来的香豆素类化合物［3］。许多研究证明，Ost具有抗氧化、抗凋亡等神经保护作用［4－6］。本研究采用含有突变位点的APP（amyloid precursor protein）基因感染神经元来构建体外AD细胞模型，观察Ost对感染APP形成Aβ沉积导致神经元突触功能的影响并探讨其机制。

1　材料与方法

1．1动物 清洁级昆明种小鼠，购于辽宁长生生物有限公司，许可证号：SCXK（辽）：2010－0001，取新生48 h内小鼠用于实验。

1．2试剂 蛇床子素购于成都普菲德生物有限公司（纯度＞98%，批号：JOT-10359），溶于二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司），终浓度＜0.01%，用DMEM（Dulbecco′s modified eagle medi-um，Gibco公司）培养液配成各浓度待用。胎牛血清（fetal calf serum，FBS，Gibco公司），青－链霉素（penicillin-strepotomycin，P／S，Thermo公司），一抗分别为兔抗NF-M、APP、Aβ1－42、synapsin-1、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1、β-actin（北京博奥森）；二抗为Cy3标记驴抗兔IgG（Jackson）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（北京鼎国）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylin-dole，DAPI）染液（Sigma），Cell Counting Kit CCK-8试剂盒（Dojindo），全蛋白提取试剂盒（南京凯基），5 ×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（南京凯基），ECL检测试剂盒（南京凯基）。

1．3仪器 Ti-S型荧光显微镜（日本尼康）、超低温冰箱（青岛海尔，DIV-86L386）、CO2培养箱（NU-AIRE，BPN）、酶标仪（深圳迈瑞，MR-96A）、紫外－可见光分光光度计（上海元析，UV-5600）、PCR仪（杭州朗基，MG96G）、凝胶成像系统（UVP，GeneGe-nius）、水平核酸电泳仪（Bio-Rad）、半干式蛋白转膜仪（Bio-Rad）。

1．4神经元的分离、培养与鉴定 取新生（48 h内）小鼠大脑并分离出大脑皮层，剪碎并用0.05%胰蛋白酶于37℃消化15 min，终止消化后经筛网过滤，得到细胞悬液。细胞悬液以5×109·L－1的密

度接种于经多聚赖氨酸包被过的24孔板中，培养于含有10%FBS和1%P／S的DMEM完全培养基中，置于37℃，5%CO2－95%空气培养箱中培养。3～4 d后加入4 mg·L－1的阿糖胞苷，48 h后更换新的培养基，以后每3 d半量换液。培养14 d后用兔抗NF-M抗体进行免疫荧光染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察鉴定［7］。

1．5APP基因转染神经元及APP表达的检测将委托北京奥科生物技术有限公司合成含突变位点的APP基因片段用XbaI和NotI双酶切后插入同样酶切的System Biosciences（SBI）公司的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的目标载体构建为慢病毒载体，按实验室所述方法［8－9］按一定比例将其转染293T（天津医科大学）包装细胞，对照组转染GFP。培养293T细胞，24 h后荧光显微镜下观察两组细胞都呈现绿色荧光。分别收集72 h内上述293T细胞培养液上清（含病毒），离心、浓缩并检测病毒滴度；用浓缩的病毒上清感染12 d的神经元；感染3 d后，用免疫细胞化学法检测APP在神经元中的表达。

1．6实验分组 对照组：感染GFP的神经元；模型组：感染APP-GFP共表达的神经元；给药组：给予24 h不同浓度（10、50、100 μmol·L－1）Ost的感染APP-GFP共表达的神经元。

1．7CCK-8检测细胞的活力 CCK-8试剂中含有的WST-8在电子偶合试剂存在的作用下，被细胞中线粒体内的脱氢酶还原为具有水溶性的黄色甲产物。使用酶标仪在450 nm处测吸光度值来反映活细胞数量。故而将神经元以5×109·L－1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的96孔板中，并以上述分组每组设3个复孔。培养15 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，并在450 nm处检测吸光度。

1．8免疫荧光细胞化学法观察各组细胞synapsin-1表达 经过分组处理的各组神经元，弃去培养基，用4%多聚甲醛室温固定30 min，1×PBS洗3次；1%Triton X-100通透30 min，1×PBS洗3次；加入兔抗synapsin-1（1∶150）4℃孵育过夜；1×PBS洗3次，加入Cy3标记驴抗兔lgG（1∶150）孵育1 h；1× PBS洗3次，加入DAPI染色液（1∶50）孵育15 min。荧光显微镜下观察拍照。

1．9ELISA法检测各组细胞PSD-95和SYP蛋白的表达 收集分组处理的各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书所示方法，利用酶标仪检测各组在450 nm处的吸光度。

1．10Western blot检测Aβ1-42、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1的蛋白表达水平 原代培养的神经元，经各组处理后，用冷的PBS冲洗，立即放入预冷的裂解缓冲液中，12 000 r·min－1，离心15 min，取上清，用BSA法测定蛋白质含量，将各组蛋白质浓度调成一致。用10%的分离胶分离蛋白，每个泳道蛋白质上样量为50 μg。电泳后将凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后将膜放入含5%BSA的TBST中封闭30 min，再用TBST缓冲液洗膜3次。将膜放入装有兔抗Aβ1－42、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1、β-actin（1∶1 000）抗体的自封袋中，4℃孵育过夜；TBST冲洗3次，将膜放入HRP标记的山羊抗兔的二抗（1∶2 000）中，室温孵育1 h，然后用TBST洗膜3次；按试剂盒配制ECL工作液，暗室中将处理好的膜片放入ECL工作液中，反应1-3 min至蛋白的荧光条带可见终止显色；凝胶成像仪观察显色情况，拍照记录，并用Image J软件分析相对灰度。相对灰度＝灰度目的蛋白／灰度β-actin。

1．11统计学分析 采用SPSS 17．0版统计软件对数据进行处理，所有数据均以±s表示，组间采用t检验或单因素方差分析。

2　结果

2．1神经元的培养与鉴定 显微镜下观察培养3 d后发现细胞已有神经元形态，大部分已发出突起。14 d后神经元较成熟，经免疫荧光染色可见，神经元胞体饱满，突起较长，连接较紧密（Fig 1）。

Fig 1 Neurons identified by immunofluresence

Fig 2 Accessed of APP and Aβ1-42expression in lentivirus infected neurons

2．2检测APP基因在神经元中的表达及Aβ1－42的生成 免疫荧光细胞化学法检测经感染3 d后的神经元，结果显示，感染了APP-GFP共表达的神经元和感染了GFP的神经元都明显表达GFP（绿色），效率达95%以上，说明感染成功；但APP（红色）只在APP感染的神经元中明显表达，而在对照组中几乎不表达（Fig 2A）。Western blot结果显示（Fig 2B），感染了APP-GFP共表达的神经元的Aβ1－42蛋白表达水平较对照组明显升高（P＜0.01），证实了体外构建AD细胞模型的成功。

2．3Ost增强感染APP基因的神经元的存活能力如Fig 3所示，与对照组相比，模型组的细胞存活率为57.4%（P＜0.01）；而给予了不同浓度Ost的给药组的细胞存活率明显升高（P＜0.01），且以给予50 μmol·L－1Ost的实验组细胞活力更为明显。因此，以下实验均以给予50 μmol·L－1Ost作为给药组（简称Ost组）。

Fig 3 Comparison of cell viability among all groups by CCK-8

2．4Ost对感染APP基因的神经元synapsin-1表达的影响 通过免疫荧光结果（Fig 4A）发现，对照组的synapsin-1阳性表达较多，突触形态比较明显。模型组的synapsin-1的荧光强度较弱为（57.00± 3.21）%（与对照组相比），而给予Ost对synapsin-1的表达明显增强，荧光强度达到（79.10±4.01）%，差异具有显著性（Fig 4B）。说明Ost可对抗感染APP所引起的synapsin-1的减少。

Fig 4 Comparison of expression of synapsin-1 among all groups

2．5Ost对感染APP基因的神经元的PSD-95和SYP表达的影响 ELISA结果显示（Fig 5），相比于对照组，模型组的PSD-95和SYP分别下调了44.7 μg·L－1与3.2 μg·L－1（P＜0.01）；而给予了Ost的给药组与模型组相比2种突触相关蛋白分别上调了20 μg·L－1与2.3 μg·L－1（P＜0.01）。说明Ost对感染APP造成的突触功能损伤具有保护作用。

Fig 5 PSD-95 and SYP concentrations measured by ELISA assay

2．6Ost调节感染APP基因的神经元内CAMKK2／AMPK通路相关蛋白的表达 根据Western blot结果可知（Fig 6），与对照组相比，模型组的CAMKK2、p-AMPKα1蛋白的表达量明显增多（P＜0.01），但对AMPKα1无明显影响；而给药组与模型组比较而言，CAMKK2下降明显（P＜0.05），p-AMPKα1下降明显（P＜0.01），对AMPKα1无影响。

3　讨论

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，主要集中在中老年时期发病。以β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑（SP）、细胞骨架蛋白tau的高度磷酸化产生的神经纤维缠结（NFTs）以及神经元和突触的缺失等为主要病理特征［10－12］。研究证实，由于位于21号染色体上的APP基因突变可生成具有神经毒性的Aβ42，所以笔者采用具有突变位点的APP基因转染神经元模拟AD来进行实验。

Fig 6 Comparison with relative protein expression of CAMKK2／AMPK

突触是两个神经元之间的紧密接触并形成特殊结构的功能接触部位，在传递信息方面起重要的作用。研究表明，多种突触相关蛋白一起来维持突触的功能并调控神经递质的释放，其中synapsin-1、SYP位于突触前膜，是有代表性的与突触囊泡相关的蛋白，主要调节神经递质的释放；PSD-95作为重要的骨架蛋白在突触兴奋和维持突触结构和功能可塑性上发挥着重要的作用［13－14］。研究表明，突触相关蛋白含量的降低与突触的丢失是AD的典型现象［15］。因此本实验在造模成功的基础上用synap-sin-1染色来显示观察突触的密度和分布情况，ELISA检测相关蛋白PSD-95和SYP的表达。最后发现Ost能明显逆转感染APP引起的突触相关蛋白的降低，说明Ost能对抗感染APP引起的突触损伤和丢失。

CAMKK2／AMPK信号通路是Aβ42诱导突触毒性过程中非常重要的调控因子，有毒性的Aβ沉积刺激了特定的神经元受体，该受体使Ca2＋大量内流从而激活了CAMKK2酶，继而激活了AMPK，作为其中的蛋白质亚型α1上的172位苏氨酸（Thr172）

的磷酸化是AMPK激活的主要机制［16－19］。所以本实验从CAMKK2与pT172-AMPKα1入手来探讨Ost对神经元突触的保护作用，最后Western blot结果发现模型组的CAMKK2与p-AMPKα1蛋白表达量明显升高（P＜0.01），Ost组的蛋白表达量较模型组明显降低，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）。综上所述，Ost有可能通过抑制CAMKK2／AMPK信号通路来逆转Aβ对神经元突触造成的损伤与丢失，但是具体的机制需要进一步研究。

（致谢：实验在导师杨静娴教授的精心指导，师兄师姐们的热情帮助下顺利进行，论文也在闫老师的辛苦修改下顺利完成。）

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Neuroprotective effect of osthole on neuron synapses infected APP gene

LI Shao-heng，JIAO Ya-nan，YAO Ying-jia，KONG Liang，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
（Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning Unversity of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of osthole onneuron synapses infected APP gene and its underlying

mechanism．Methods The neurons were divided into three groups：GFP，APP，APP＋Ost groups．The neu-rons were infected APP gene with containing mutational site in vitro for mimicking the characterstics of Alzhei-mer’s disease（AD）．The cell viability was assessed by CCK-8，the expression of synapsin-1 was deter-mined by immunofluorescence，and the concentration of PSD-95 and SYP were detected by ELISA．The ex-pressionsof Aβ1-42，CAMKK2，phoshorylated AMPKα1，AMPKα1 protein were determined by West-ern blot．Results Strong APP staining was visible in neurons infected with APP and abundant expression of Aβ1-42，a neurotoxic oligomer．Compared with APP group，APP＋Ost group significantly increased cell vi-ability，promoted the expression of synapsin-1，up-reg-ulated the concentration of PSD-95 and SYP，and de-creased the expressions of CAMKK2 and p-AMPKα1．Conclusions Ost can protect the neuron synapses a-gainst infected with APP gene．Its neuroprotective effect may be related to inhibiting the CAMKK2／AMPK signal pathway．

Key words：osthole；neurons；synapses；infection；Alzheimer’s disease；CAMKK2／AMPK signal pathway

作者简介：李少恒（1992－），男，硕士生，研究方向：中药神经药理学，E-mail：lsh199242＠163．com；杨静娴（1963－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：神经药理学，通讯作者，Tel：0411-87586009；E-mail：jingxianyang＠yahoo．com

基金项目：国家自然科学基金面上项目（No 81173580）

收稿日期：2015－06－29，修回日期：2015－08－12

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1383－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．012