姜黄素眼用脂质体的角膜透过性研究*

摘要：目的：研究姜黄素眼用脂质体的角膜透过性。方法：采用乙醇注入法制备姜黄素脂质体，以三甲基壳聚糖对脂质体囊泡进行包覆；采用过膜法、粒径及电位测定仪对脂质体进行理化性质分析；采用离体兔角膜透过实验及共聚焦激光扫描显微镜成像技术，对三甲基壳聚糖包覆的脂质体的角膜透过作用进行研究。结果：三甲基壳聚糖对脂质体的包覆对脂质体的包封率无明显影响，但粒径、电位有所增大，同时角膜透过显著高于未包覆脂质体组，随着作用时间的延长，可促进脂质体囊泡渗透至角膜上皮深层60 μm处，并主要以细胞旁路途径发生角膜透过。结论：该研究表明三甲基壳聚糖对脂质体囊泡具有明显的角膜促透作用。

关键词：三甲基壳聚糖；姜黄素；角膜透过；共聚焦激光扫描显微镜成像

白内障是世界首位致盲因素，也是我国第一位的致盲眼病。研究表明自由基及其相关的氧化应激是导致晶状体生理功能改变、最终导致白内障的关键步骤[1]。姜黄素(Curcumin，缩写为Cur)为姜黄中提取的有效成分，具有抑制脂质过氧化、清除羟自由基、增强抗氧化物酶活性，抑制诱导性氧化氮合酶(iNOS)的活性。通过大鼠硒性白内障动物模型的建立，本课题组发现，姜黄素脂质体可改善晶状体的生化指标，抑制硒性白内障导致的晶状体氧化过程[2]。

然而角膜上皮层的紧密连接可封闭细胞顶部的细胞间隙，阻挡细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织，是眼用药物生物利用度极低的主要原因之一[3]。研究表明壳聚糖可通过打开细胞上皮层紧密连接，从而促进药物的肠吸收[4]，然而眼部生理环境下，壳聚糖分子无法以离子状态存在、水溶性变差，因此本文以自制三甲基壳聚糖为脂质体囊泡的包覆材料，以期荷正电性更高、水溶性更强的三甲基壳聚糖可对难溶性药物姜黄素的角膜透过性起到促进作用。

1材料与试药

1.1材料天然蛋黄卵磷脂(PC-98T，上海艾韦特医药科技有限公司，批号EL11005)；高纯胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司，批号A90719)；氧化型谷胱甘肽(北京Solarbio公司，批号G8690)；三甲基壳聚糖(Trimethyl chitosan chloride，TMC，自制，季铵化37.5%)；其他试剂均为分析纯。

1.2试药姜黄素(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3动物日本大耳兔(普通级，南昌龙平兔业有限公司，许可证号：SCXK(赣)2009-0001。

2方法与结果

2.1姜黄素包覆脂质体的制备采用乙醇注入法制备姜黄素未包覆脂质体(Cur-loaded liposomes，简写为Cur-L)，称取处方量Cur、天然蛋黄卵磷脂、高纯度胆固醇溶于2 mL乙醇(姜黄素为1.41 mg、4%磷脂浓度、胆固醇：磷脂质量比为1∶5.44)，磁力搅拌下将制备的类脂溶液缓慢匀速注入10 mL水溶液中(50 °C)，保持该温度下除去乙醇，超声均化(100 W，3 min)，得到透明乳光混悬液。

配制1%的TMC的水溶液，注入到同等体积的Cur-L中，在4 ℃条件下磁力搅拌30 min，即得三甲基壳聚糖包覆Cur脂质体(TMC-coated Cur-loaded liposomes，简写为TMC-Cur-L)。

2.2色谱条件色谱柱为phenomenex luna C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流动相为乙腈：0.2 %乙酸=58∶42；流速为1.0 mL/min；柱温为30 °C；检测波长为426 nm；进样量为20 μL。按上述色谱条件，以样品的色谱峰峰面积(A)对Cur浓度(C，μg/mL)进行线性回归，得到标准曲线方程为A=174.17C-62.873(r=0.9999)。可见在该色谱条件下，Cur在该浓度范围内，色谱峰峰面积(A)与浓度(C)呈良好的线性关系。

2.3理化性质测定采用过膜法[5]测量姜黄素脂质体的包封率。采用0.22 μm水系滤膜，精密吸取过膜前后脂质体，无水乙醇破乳，各取20 μL进样，测定包含脂质体中总药物峰面积和过膜后除去游离药物的脂质体的峰面积。包封率测定公式：

包封率(%)=过膜后的药物峰面积/过膜前药物总峰面积×100。

取脂质体混悬液适量，稀释至适当倍数，用粒径及ζ电位测定仪测定脂质体的粒径大小和Zeta电位。

姜黄素脂质体的理化性质测定结果见表1。

制剂包封率/%粒径/nmZeta电位/mVCur-L94.5±0.2104.1±1.91.75±0.1TMC-Cur-L92.3±0.4147.5±2.313.2±0.1

2.4眼部刺激性实验取健康家兔4只，左眼结膜囊内滴入0.1 mL生理盐水为对照，右眼结膜囊内滴入0.1 mL Cur-L及TMC-Cur-L，滴眼后轻轻闭合眼睑约10 s，分别于点药后1，24，48，72 h对眼部进行检查[6]。根据国家食品药品监督管理局2005年《眼刺激反应分值标准》评分记录，结果显示与对照组相比，给药组角膜透明，虹膜清晰，结膜未充血，无水肿及分泌物，手电配备放大镜检查角膜病变，评分均为0。

2.5扩散介质的配制新鲜配制谷胱甘肽-碳酸氢钠林格溶液的配制：一部分含氯化钠12.400 g/L，氯化钾0.716 g/L，磷酸二氢钠0.206 g/L，碳酸氢钠4.908 g/L；另一部分含五水氯化镁0.318 g/L，二水氯化钙0.230 g/L，葡萄糖1.800 g/L，氧化型谷胱甘肽0.184 g/L，低温储存，用前等量混合。

2.6离体兔角膜的制备耳缘静脉注射空气处死家兔，用镊子剪断动眼肌及视神经丛，摘除眼球，冲去表面附着的血块，置于34 °C预热的林格溶液中。由视神经丛向前剖开眼球，剥离眼球后部组织，撕去虹膜得到带有2 mm巩膜环的角膜。操作过程尽量避免接触角膜以防造成角膜表面损伤。处死动物后20 min内开始体外角膜透过实验[7]。

离体兔角膜透过实验步骤：采用改良Franz扩散池。将新鲜离体兔角膜保持角膜弯曲形状，固定在供给池和接受池之间(角膜有效扩散面积为0.5 cm2)，使上皮层面向供给池。在供给池中加入0.5 mL待测制剂，在接受池中加入5 mL新鲜配制的林格溶液。

2.7共聚焦激光扫描显微镜成像在设定时间点60min、150min时冲洗供给池和接受池除去多余的荧光溶液，取出角膜，滤纸吸干角膜表面后置于共聚焦激光成像仪(ZEISS LSM 710，德国蔡司公司)的载物台上，进行CLSM成像分析。检测条件：物镜放大倍数×63，HeNe激光源的激发波长为激发波长485nm，发射波长538nm。油镜观察，每帧0.44 μm，进行3D成像。结果见图1-2。

(A) Cur-L/60min; (B) Cur-L/150min;

由图1可见，当作用时间为60 min时，Cur-L组荧光几乎无法检测，而TMC-Cur-L组可渗透至40 μm深度，随着作用时间的延长，与角膜作用150 min后，Cur-L可渗透至角膜上皮层10 μm处，然而TMC-Cur-L的角膜渗透性增强、信号强度增大至角膜上皮层60 μm处仍可检测到荧光信号。

图2　TMC-Cur-L组兔角膜横截面截图

由上述结果可知，TMC-Cur-L组对姜黄素的角膜透过作用显著，针对TMC-Cur-L，当作用时间为150 min时，沿Y轴方向，水平扫描角膜上皮层。从角膜表面开始，每0.44 μm深度扫描一次，CLSM成像结果如图2所示。由图2可见，TMC-Cur-L与离体角膜相互作用后，荧光信号主要分布在细胞周围，只有少数在胞浆中，说明TMC-Cur-L主要通过细胞旁路途径透过角膜。

2.8角膜水化值的测定角膜水化值是体外评价角膜刺激性的重要指标。正常角膜水化值为76 %～80 %。将新取角膜及上述体外角膜透过实验结束后的角膜(仅留暴露于扩散介质的角膜区域)称重，记为Wa；经70 °C干燥12 h后称重，记为Wb。角膜水化值(H %)由下列公式计算求得，结果见表2。

样品水化值/%新鲜角膜77.4±0.4Cur-L78.3±0.9TMC-Cur-L81.7±1.2

3讨论与结论

三甲基壳聚糖作为壳聚糖的衍生物，水溶性增强、荷正电性提高，由于角膜与肠道黏膜结构类似，因此认为自制三甲基壳聚糖可以类似壳聚糖促药物肠吸收的机制，达到促药物角膜透过的目的。研究表明，在肠道壳聚糖通过C-2上的正电氨基与细胞膜和紧密连接处的负电位点相互作用，从而打开紧密连接[8-9]。因此分析TMC可以上述相同或相似的机制打开角膜上皮细胞间的紧密连接促进脂质体经细胞旁路透过角膜。

参考文献

[1]Resnikoff S, Pascolini D, Etya'ale D, et al. Global data on visual impairment in the year 2002[J].Bull World Health Organ, 2004, 82:844-851.

[2]倪斌, 李翔, 罗云, 等. 黄素眼用脂质体的制备及晶状体抗氧化作用考察[J].中国实验方剂学杂志, 2014, 20 (6): 5-9.

[3]Yavuz B, Pehlivan SB, Ünlü N. Dendrimeric systems and their applications in ocular drug delivery[J].Scientific World J, 2013: 732 340.

[4]Shrestha N, Shahbazi MA, Araújo F, et al. Chitosan-modified porous silicon microparticles for enhanced permeability of insulin across intestinal cell monolayers[J].Biomaterials, 2014, 35 (25): 7 172-7 179.

[5]任瑾, 方正杰, 印晓星, 等. 槲皮素前体脂质体的质量考察[J].中国现代应用药学, 2013, 30 (1): 39.

[6]化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则. 国家食品药品监督管理局药品注册管理方法文件. 2005: 14-16.

[7]李德馨.抗白内障前药双硫仑经眼给药传递系统及作用机制[D].沈阳药科大学, 2005.

[8]Schipper NG, Olsson S, Hoogstraate JA, et al. Chitosan as absorption enhancers for poorly absorbable drugs 2: mechanism of absorption enhancement[J].Pharm Res, 1997, 14: 923-929.

[9]van der Lubben IM, Verhoef JC, Borchard G, et al. Chitosan and its derivatives in mucosal drug and vaccine delivery[J].Eur J Pharm Sci, 2001, 14: 201-207.

The Effect of N-trimethyl Chitosan as Coating Materials on Corneal Permeability of Curcumin

ZHANG Jing1, LI Xiang2, LUO Yun1, LIANG Xin-li1, LIAO Zheng-gen1

1.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.

Abstract:Objective: To study the effect of N-trimethyl chitosan as coating materials on corneal permeability of curcumin. Methods: Curcumin-loaded liposomes were prepared by ethanol injection method, and the vesicles were coated with trimethyl chitosan. Membrane filter, dynamic light scattering and electrophoretic light scattering were employed to study the physicochemical parameters. Corneal permeability of trimethyl chitosan-coated liposomes was carried out by transcorneal permeation study and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results: It was shown that the entrapment efficiency was not changed significantly with enlarged size and zeta potential with the coating of TMC. The TMC-coated liposomes produced the more pronounced corneal permeation, compared with the uncoated preparations. With the increased contact time, the fluorescence in rabbit corneal epithelium can be detected down to 60 μm below the surface via paracellular route. Conclusion: TMC has significant effect on the transport of curcumin through rabbit cornea in vitro.

Key words:N-trimethyl Chitosan; Curcumin; Corneal Permeability; Confocal Laser Scanning Microscopy

收稿日期：(2014-06-27)编辑：曾文雪

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

基金项目：*国家自然科学 (81202927)；江西省教育厅青年 (GJJ12535、GJJ12536)；江西省卫生厅中医药科研计划项目(2012A160、2012A157)；江西省青年科学基金项目(20122BAB215018、20132BAB215022、20114BAB215038)；江西省科技支撑计划项目(20123BBG70181)。

通信作者：★张婧1李翔2罗云1梁新丽1廖正根1*廖正根，博士，教授。研究方向：中药新剂型与新技术。Tel：(0791)87119190，E-mail:lyzlyg@163.com。(1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室南昌 330004；2.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心南昌 330006)