宗成国,霍红琳,张　婷,李红敏

(大连大学附属中山医院 检验科,辽宁 大连116001)



脂联素基因SNPs-11377C/G多态性与女性乳腺癌的相关性

宗成国,霍红琳,张婷,李红敏

(大连大学附属中山医院 检验科,辽宁 大连116001)

摘要：目的探讨脂联素基因SNPs-11377C/G多态性与女性乳腺癌发生的相关性。方法用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)技术观察脂联素基因在不同人群中的单核苷酸多态性，其中包括乳腺癌组患者70人，健康对照组30人。结果SNPs-11377C/G等位基因频率在乳腺癌和正常对照组间分布差异无统计学意义(P>0.05)，乳腺癌患者组CG基因型分布频率高于GG型和对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌组CC基因型CA153与CEA表达水平高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论脂联素基因启动子区SNPs-11377C/G基因多态性与乳腺癌疾病发生有相关性。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1071)

脂联素(adiponectin，APN)是一种脂肪细胞特异性高分泌，具有多种功能的细胞因子，能提高组织对胰岛素敏感性。血浆脂联素水平可能与胰岛素抵抗、肥胖、胰岛素血症呈负相关，另外也与乳腺癌负相关[1-3]。最近研究表明低循环的脂联素水平与女性乳腺癌发病率提高密切相关，且与年龄、绝经情况、体质情况等无相关性。正常人脂联素基因序列中存在相当数量的等位基因单核苷酸多态性(SNPs)，但这些密码子的变化并不改变其编码蛋白质的氨基酸序列。然而，脂联素基因5′ 侧翼区SNPs-11377C/G的变化，可能直接影响脂联素的血浆水平[4]，进而影响女性乳腺癌等疾病的发生和发展。本研究采用PCR-RFLP技术分析脂联素基因启动子区SNPs-11377C/G基因型和等位基因频率，旨在探讨脂联素基因启动子区SNPs-11377C/G基因多态性与女性乳腺癌发生的相关性，为开展乳腺癌的基因诊断和基因治疗提供理论依据。

1材料和方法

1.1研究对象来源于2011年至2012年我院普外科因乳腺癌住院患者及我院健康体检者，分为乳腺癌组和正常对照组。① 乳腺癌组：70人，临床已确诊的乳腺癌患者。②正常对照组：30例，健康体检者。

1.2　研究方法

1.2.1生化指标受试者于清晨空腹静脉取血使用免疫分析仪检测癌胚抗原(CEA)、CA153、CA125。

1.2.2脂联素基因启动子区SNPs-11377C/G基因型多态性的PCR-RFLP分析

①DNA的提取：取空腹静脉血0.3 ml(EDTA抗凝)用全血DNA提取试剂盒(上海华舜公司)提取基因组DNA。 提取的基因组DNA，于-20℃保存备用。

②PCR扩增：从Genebank中查取人apM1基因序列，应用primer premier 5.0软件设计引物，并由TaKaRa公司(大连)合成。

上游引物 5′ TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG 3′ ；

下游引物 5′ TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG 3′。

PCR 反应体系(25 μl)):模板DNA1.5 μl，上下游引物各1.3 μl，2×Master Mix(TaKaRa大连公司) 12.5 μl，ddH2O 8.4 μl。

PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 变性1 min，61 ℃ 退火30 sec，72℃延伸1 min，共36个循环，完成后72℃ 维持10 min，扩增在PCR仪(Thermo公司)上完成。反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物片段为329 bp。

③酶切：用Hhal(TaKaRa公司)限制性内切酶酶切，37℃酶切水解4-16 h,取5 μl酶切产物置2%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。

2结果

2.1　SNPs-11377C/G基因多态性3种酶切电泳结果(见图1)

以人类基因组DNA为模版，目的基因脂联素基因启动子区SNPs-11377(C/G)扩增产物长度为329bp,此多态性位点可被限制性内切酶Hhal识别，酶切产物片段长度分别为CC(329bp)，CG(329bp;211bp;118bp),GG(211bp;118bp)。

图1脂联素基因启动子区SNPs-11377(C/G)酶切电泳。(M：Marker;1、2、3、4、5、6、9：CC基因型；7、8、15、16：CG基因型；13、14：GG基因型)

2.2　SNPs-11377C/G基因型及等位基因频率分布

以Hardy-Weinber平衡检验乳腺癌组和正常对照组的基因型频率，等位基因的分布具有群体代表性(P>0.05)(见表1)。SNPs-11377C/G等位基因频率在对照组和乳腺癌组两组间分布差异无统计学意义(χ2=0.180；P=0.672)，但CG基因型与GG基因型相较，CG基因型在乳腺癌组的分布频率高于GG基因型的分布频率，且与对照组相比差异有统计学意义(χ2=5.649；P<0.05)，其他各基因型间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　乳腺癌组和对照组SNPs-11377C/G基因型及等位基因频率分布

2.3　组间肿瘤标志物表达水平的比较

乳腺癌患者的CEA、CA153的均值明显高于正常对照组(P<0.05)，差异有统计学意义(见表2)。

±s)

2.4　基因型分组临床资料比较

在乳腺癌组和正常对照组中均以基因型分组，在对照组与乳腺癌组内，各基因型肿瘤标志物表达水平无显著性差异，差异无统计学意义(P<0.05)。乳腺癌组CC基因型CEA表达水平高于对照组(P=0.0133)，CA153的表达水平高于对照组(P=0.0072),差异有统计学意义。

3讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约120万女性发生乳腺癌。在我国大中城市中，乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤的前两位。

±s)

乳腺癌发生的高危因素和机制与肥胖、糖尿病、高血压、高血脂等因素相关，乳腺癌为雌激素依赖性肿瘤，雌激素为细胞有丝分裂的刺激因子，可促进癌症发生、发展。乳腺癌的早期诊断对降低乳腺癌的死亡率有着重要的意义。脂联素在调节机体糖和脂肪代谢、维持机体能量代谢平衡中发挥着重要作用，且为基因表达过程中较为丰富的转录产物。脂联素分泌失衡与糖、脂肪代谢异常相关疾病密切相关[1，5，6]，有报道认为，脂联素还可能通过调节雌激素-胰岛素水平参与乳腺癌的发生，低脂联素可能改变激素与细胞因子的作用，从而增加了乳腺癌等肿瘤的发病率[6]，但具体机制目前尚不清楚。

正常人APN-1基因中存在相当数量的等位基因SNPs，且有较大频率的基因多态性，但是密码子的变化并不改变其编码蛋白质的氨基酸的序列，染色体3q27区域同时存在2型糖尿病，代谢综合征和冠心病的易感位点[7]，Gu[4]等人的研究表明脂联素基因5′ 侧翼区SNPs-11377C/G等变化可能直接影响脂联素的血浆水平，可能与其改变了APN-1基因上游的某些转录元件有关[8]。Vasseur[9]等人不仅发现-11377C/G基因多态性与2型糖尿病相关，他们还发现SNPs-11391G/A或SNPs-11377C/G的基因型决定了糖尿病患者的脂联素的水平。在我们的研究中，乳腺癌人群中-11377C/G的等位基因频率(C=71.4，G=28.6)，与正常对照组无统计学意义(P<0.05)，与国外报道的正常人平均基因频率接近[C=75.4，G=24.6(rs266729,NCBI)]，其原因可能与本研究排除糖尿病患者有关也可能与我们的样本量较少有关。另外，在本研究中我们发现，与正常对照组相比，在乳腺癌患者中CG基因型分布频率高于GG型，且差异有统计学意义，这提示我们，可能在人群中CG基因型对乳腺癌较GG基因型有较高易感性，说明脂联素基因多态性与乳腺癌的发生有相关性。但要观察其是否有普遍意义应加大样本量，并观察这两组脂联素的表达水平。

在本研究中，乳腺癌人群血脂指标明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，叶枫[10]等研究结果显示，脂联素基因启动子区SNPs-11377C/G的G等位基因可能是肥胖的易感基因之一，提示我们乳腺癌的发生、发展可能与肥胖有一定的相关性，且有研究发现GG基因型舒张压，收缩压，甘油三酯均有明显增高趋势。乳腺癌患者血清中CA153与CEA的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义，CA153对乳癌有较好的敏感性和特异性，被认为是乳腺癌的首选肿瘤标志物，与乳腺癌的发生、发展具有密切的关系。乳腺癌患者血清CEA的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。在本研究中，我们发现乳腺癌患者SNPs-11377CC基因型的CA153与CEA的表达水平明显高于对照组，提示，SNPs-11377CC型可能参与了乳腺癌的发展过程。

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[10]叶枫,何岚,李建宁,等,脂联素基因启动子区多态性与肥胖、2型糖尿病的相关性[J].西安交通大学学报,2008,29(1):74.

关键词：乳腺癌；脂联素；基因多态性

Association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for femaleZONGCheng-guo,HUOHong-lin,ZHANGTing,etal.(ZhongshanHospitalAffiliatedtoDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for female.MethodsThe PCR-RFLP techniques were adopted to test SNPs in the proximal promoter region of the APM1 gene in 30 normal control group and 70 breast cancer group.ResultsThere were no significant difference of the distribution of the Gensini coronary scores in the two groups(P>0.05).The frequencies of CG were higher than GG in breast cancer compared with normal.In breast cancer group,serum CA153 and CEA level of GG genotype and CC genotype at position-11377 were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionThe results suggest that SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene may contribute to the risk of breast cancer for female.

Key words:breast cancer；adiponectin；gene polymorphism

(收稿日期：2014-05-26)

文献标识码：A

中图分类号：R737.9

文章编号：1007-4287(2015)07-1071-03