CLIC4-RNAi对 H2O2诱导的U251损伤细胞中线粒体膜电势的影响

袁兆新1， 许祯杰2，张艳3*

(1.长春医学高等专科学校，吉林 长春130031；2.日照市人民医院;3.吉林大学中日联谊医院)

作为细胞内氯通道家族成员之一的细胞内氯通道4(CLIC4) 也称之线粒体细胞内氯通道(mtCLIC)，是细胞内氯通道家族中唯一在线粒体上表达的氯通道[1]，最近大量研究表明CLIC4也参与了细胞凋亡过程[2，3]。本实验通过过氧化氢(H2O2)复制神经胶质瘤(U251)细胞损伤模型，检测线粒体膜电势的改变，探讨CLIC4-RNAi对H2O2诱导的U251损伤细胞的线粒体膜电势的影响及其相关机制。

1材料与方法

1.1　材料

pSilencerTM 3.1-H1 neo siRNA载体购自Ambion公司(美国)。

1.2　细胞培养

人神经胶质瘤细胞株U251，接种于含10%胎牛血清的DMDM培养液中培养。

1.3　细胞线粒体提取

收集细胞PBS洗两遍，转入EP管中弃上清，按试剂盒流程提取。

1.4　Rhodamine123法检测线粒体膜电势

取线粒体颗粒悬液，取Rhodamine 123，4℃离心弃上清，线粒体悬液上流式细胞仪检测，计算平均荧光强度。

1.5　统计学处理

2结果

2.1　Rhodamine123法流式细胞仪检测线粒体膜电势

线粒体悬液上流式细胞仪，检测RNAi-CLIC4组与RNAi-Scramble组细胞线粒体膜电势，计算荧光强度，结果如图1所示。

A.Uninfected ;B.RNAi-Scramble C.RNAi-CLIC4

2.2　H2O2诱导的U251损伤细胞中线粒体膜电势比较分析

见表1。与Uninfected组以及RNAi-Scramble组细胞相比，RNAi-CLIC4组在不同H2O2浓度诱导的细胞线粒体膜电势明显降低(P<0.05)。

表1　H2O2诱导的U251损伤细胞中线粒体膜电势比较

#P<0.05 vs RNAi-Scramble;*P<0.05 vs Uninfected

3讨论

相关研究已经证明CLIC4在H2O2诱导的细胞损伤中表达明显增高，与细胞的损伤明显相关[4]。在成功构建高效CLIC4-RNAi模型基础上[5]，本试验中探讨了下调CLIC4表达之后对H2O2诱导的U251细胞损伤过程中的线粒体膜电势产生的影响。在细胞正常生理情况下，细胞内氯通道4对线粒体内环境稳定、离子平衡具有重要的调节作用[6]。本研究结果表明，RNAi-CLIC4组细胞在不同剂量的H2O2诱导的损伤细胞中线粒体膜电势发生改变，出现显著下降，这说明线粒体膜电势在这一过程中对CLIC4的变化十分敏感，有可能启动或促进细胞的线粒体损伤过程，而由于线粒体膜电势的丧失对线粒体PT孔开放、CytC释放、线粒体内pH值改变等过程中发挥重要作用，相关作用机制将在后续研究中进一步探讨。

参考文献：

[1]Duan D,Winter C,Cowley S,et al.Molecular identification of a volume-regulated chloride channel[J].Nature,1997,390 (6658):417.

[2]Suh KS,Mutoh M,Nagashima K et al.The organellular chloride channel protein CLIC4/mtCLIC translocates to the nucleus in response to cellular stress and accelerates apoptosis [J].J Biol Chem,2004,279(6):4632.

[3]Xue L,Borutaite V,Tolkovsky AM.Inhibition of mitochondrial permeability transition and release of cytochrome c by anti-apoptotic nucleoside analogues [J].Biochem Pharmacol,2002,64(3):441.

[4]孔晓霞，张宏宇，孙连坤.内毒素对过氧化氢引起的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响[J].吉林大学学报(医学版)[J].2009,35(1)：17.

[5]袁兆新，康劲松，孔晓霞.细胞内氯通道4基因siRNA表达载体的构建及其沉默效应[J].中国实验诊断学[J].2009，13(2):146.

[6]Yu SP,Lorella MT Canzoniero ,Dennis W Choi.Ion homeostasis and apoptosis[J].Current Opinionin cell Biology,2001,13(4):405.

(收稿日期：2014-06-16)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2015)07-1060-02