章 武，刘国道，南志标*

（1．兰州大学草地农业科技学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730020；2．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室，海南儋州571737）

4种暖季型草坪草币斑病病原菌鉴定及其生物学特性

章 武1，刘国道2，南志标1*

（1．兰州大学草地农业科技学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730020；2．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室，海南儋州571737）

2011－2013年对海南省多个高尔夫球场及校园绿化草坪进行调查期间发现一种类似于草坪币斑病且可严重危害4种暖季型草坪草的草坪病害。根据科赫法则验证、形态学观察以及ITS序列分析的结果，确定引起海南省币斑病的病原菌为Sclerotinia homoeocarpa，这是我国首次报道S.homoeocarpa危害杂交狗牙根和地毯草。生物学特性研究表明：S.homoeoparpa生长的适宜温度为25～30℃，最适温度为28℃；适宜p H值为4～6，最适p H值为5；菌丝的致死温度为55℃水浴处理10 min；光照有利于菌丝生长。S.homoeoparpa能够利用多种碳氮源：碳源测试中，对可溶性淀粉利用率较高，对D-甘露醇和D-阿拉伯糖利用率较低；氮源测试中，病菌对硝酸铵、磷酸二氢铵的利用效果最佳，对脲利用效果最差。

暖季型草坪草；币斑病；Sclerotinia homoeocarpa；生物学特性

2010年4月，国务院发布了《推进海南国际旅游岛建设发展的若干意见》，将海南国际旅游岛建设正式上升为国家战略，赋予了海南合理规范发展高尔夫产业的特殊政策；与此同时，高尔夫重返奥运会，成为2016年奥运会正式比赛项目。环境优美的海南岛高尔夫产业正面临着其他地区所没有的机遇和政策优势。然而，随着海南高尔夫球场数量不断增加，草坪建植面积的不断扩大和养护要求的不断提高，草坪病害防控已成为草坪管理中一个不可忽视的重要问题。

虽然我国草坪病理学的研究基础相对薄弱，但随着草坪业的快速发展，我国关于草坪病害的种类和分布的研究也呈现逐年增加的趋势。截止1994年，南志标和李春杰［1］统计了我国包括草坪草在内的禾本科植物真菌病害1289种，病原真菌391种，其中锈菌146种，黑粉菌65种，半知菌101种，其他真菌75种。多位草坪学者与专家也在全国范围内的不同地区，不同寄主的草坪病害进行了深入调查研究，详细记录了草坪的主要病害种类，危害状况，分布情况［2-6］，并提出了相对应的综合防治措施［7-9］。然后，我国对草坪病害的研究尚不十分系统，仍需加强对主要草坪病害病原菌鉴定、生物生理学特性、病害流行学、生态学、遗传多样性、病害的防控与预防等方面做出深入系统的研究。

草坪币斑自1932年由Monteith和Dahl［10］首次在美国发现报道以来，已在北美、中美、欧洲、澳洲、日本和中国等全球各地均有报道。引起草坪币斑病病原菌是Sclerotinia homoeocarpa。该病害币斑病得名于其典型的危害症状：发病草坪上形成圆形、凹陷、稻草色的约钱币大小斑块。币斑病菌除了可危害禾本科草坪草外，还能侵染石竹科、旋花科、莎草科和豆科在内的500多种植物［11］。直到2010年，该病才首次在我国报道［12-13］。币斑病可危害我国各地多种草坪草，尤其对高尔夫球场球道、果岭低修剪草坪危害最严重［13］。然而该草坪病害尚未在我国海南省有过报道的记录。

2011－2013年对海南多家高尔夫球场及校园绿化草坪草病害进行了调查，发现海滨雀稗（Paspalum vaginatum）、杂交狗牙根（Cynodon dactylon×C.transvaalensis）、结缕草（Zoysia spp．）、地毯草（Axonopus compressus）建植的草坪上经常出现圆形或近圆形的直径为2～15 cm的枯草斑。单株叶片染病时，叶片首先出现水浸状，而后逐渐扩大形成贯穿整叶的大斑，通常在叶片病斑边缘会形成一圈红褐色条带。该种病害的症状与S. homoeoparpa真菌引起的币斑病症状十分相似［14］。为了明确该病害的病原，笔者通过对海滨雀稗、杂交狗牙根、结缕草、地毯草4种暖季型草坪草染病草坪病原菌进行分离鉴定，并对该病原菌的生物学特性进行了研究，为科学防治该草坪病害奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 病原菌的分离和纯化

选择病斑典型的发病海滨雀稗、杂交狗牙根、细叶结缕草（Zoysia tenuifolia）、地毯草叶片冲洗干净后，在病健交界处剪下3 mm×3 mm的小块组织，置于2．5%的次氯酸钠溶液中消毒1 min，无菌水冲洗3次后置于马铃薯葡萄糖琼脂［PDA，添加庆大霉素（1 m L／L）以抑制细菌生长］培养基上，25℃恒温培养。病原菌经纯化后保存于PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱贮存备用。

1．2 分离物回接测定致病性

1．2．1 离体叶片菌饼接种 采取健康且生长均匀的地毯草叶片用自来水冲洗干净，然后用70%酒精擦洗组织表面，切取长度8 cm的叶片，晾干后置于铺有无菌滤纸直径为9 cm的无菌培养皿中，每个分离物接种3枚叶片，即为3个重复。在培养3 d的菌落边缘打取直径为5 mm的菌丝块，将长有菌丝的一面盖于叶片上，每片叶片接种2个菌块，喷洒无菌水保湿，2 d后除去接种的菌丝块，以接种无菌的培养基块叶片作为对照，4 d后观察发病情况。

1．2．2 温室盆栽菌饼接种 将田间土壤和细沙按5∶5体积混匀灭菌后，分装在直径10 cm塑料花盆中，将海滨雀稗、结缕草、狗牙根草籽播种于土壤中，保持湿润，置于25℃温室中培养6周后备用。采用5 mm打孔器在培养5 d的菌落边缘打取菌饼，将菌饼均匀的置于寄主叶片上。每盆盆栽接种10个菌饼，每个分离物接种3盆盆栽，并套袋保湿，以接种不带菌的培养基块作为对照，定期观察发病情况，并进行记录。

1．3 病原菌鉴定

1．3．1 形态学鉴定 将分离所得病原菌置于25℃条件下黑暗培养。5 d后观察培养基上各菌落形态，并在光学显微镜下观察菌丝结构特征；20 d后观察病原菌菌落上子座组织的产生情况，并在光学显微镜下观察其结构特征。

1．3．2 病原菌的分子鉴定 参照White等［15］设计r DNA-ITS区通用引物ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（上海英骏生物技术有限公司合成），以分离自4种草坪草币斑病病原菌基因组为模板进行PCR扩增，预期产物约580 bp。PCR扩增体系：10×PCR Buffer 5 μL，d NTP Mixture 4μL，20μmol／L引物各1μL，5 U／μL Taq酶0．25μL，模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应条件：94℃预热4 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃1 min，共34个循环；72℃延伸5 min。将所有PCR产物分别加入1．0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像仪检测，用回收试剂盒回收纯化PCR产物。将胶回收产物委托上海英俊生物有限公司进行DNA测序。将分离所得病原菌的ITS序列与Gen-Bank核酸数据库进行比对，根据病菌的形态特征、培养性状和致病性，结合序列分析，对病原菌进行鉴定。并用MEGA 5．0进行系统发育分析和进化树构建，用Neighbor-joining法构建进化树，自展次数为1000次。

1．4 病原物生物学特性

1．4．1 试验材料 对分别分离自海滨雀稗、杂交狗牙根、细叶结缕草、地毯草的4个币斑病菌株ML7-3、TDC-1、HD8-1、HE-1进行生物学特性研究。

1．4．2 温度对菌丝生长的影响 在生长良好的菌落边缘用直径5 mm的打孔器围绕同心圆打孔，将菌饼接种于PDA平板上，每处理4次重复，置于5，10，15，20，22，25，28，30，35℃9个不同温度，在黑暗培养箱中培养。48 h后用十字交叉法量取菌落直径。

1．4．3 p H值对菌丝生长的影响 PDA灭菌之后，在无菌条件下用1 mol／L NaOH和1 mol／L HCl将p H值分别调节至4，5，6，7，8，9，10七个梯度。在生长良好的菌落边缘用直径5 mm的打孔器围绕同心圆打孔，将菌饼分别接种于不同p H值的平板上，每处理4次重复，置于25℃黑暗培养箱中培养。48 h后用十字交叉法量取菌落直径。

1．4．4 菌丝的致死温度的测定 在生长良好的菌落边缘用5 mm打孔器围绕同心圆打孔，挑取菌饼放入10 m L离心管中，加入1 m L无菌水，分别在35，40，45，50，55，60，65℃的恒温水浴中处理10 min，以未经水浴处理的菌饼作为对照。将菌饼取出后移至PDA平板培养基上，每皿1个菌饼，每处理4次重复，置于25℃黑暗培养箱中培养。96 h后观察各菌株的存活状况。

1．4．5 光照对菌丝生长的影响 将已接种的PDA培养皿分为3组，做如下处理：1）25℃持续光照培养48 h（光照培养箱）；2）25℃持续黑暗培养48 h；3）25℃黑暗12 h与光照12 h交替培养48 h。每个处理重复4次，48 h测量菌落直径，计算菌落平均生长速度。

1．4．6 碳、氮源对菌丝生长的影响 以Czapek培养液（2．00 g KNO3，1．00 g KH2PO4，0．5 g KCl，0．5 g MgSO4·7 H2O，0．01 g FeSO4，30．0 g蔗糖，1000 m L蒸馏水）为基础培养液［16］。分别用含相同摩尔质量碳元素的9种不同碳源代替原培养基中的葡萄糖，以不加葡萄糖的培养基作为对照，分别制成含有不同碳源的平板；分别用含相同摩尔质量氮元素的7种不同氮源代替原培养基中的硝酸钾，以不加氮源的培养基作为对照，分别制成含有不同氮源的平板。在生长良好的海滨雀稗菌株（ML7-3）菌落边缘用直径5 mm的打孔器围绕同心圆打孔，将菌饼分别接种于不同碳、氮源的平板上，每处理4次重复，置于25℃黑暗培养箱中培养。48 h后用十字交叉法量取菌落直径，计算菌落生长速率。

1．4．7 数据统计与分析 用SAS软件（Version 9．0）中的方差分析程序，分析温度、p H值、光照、碳源和氮源对病菌菌丝生长的影响，并用最小显著差数法（LSD）比较不同处理的差异显著性（P＜0．05）。

2 结果与分析

2．1 币斑病的危害症状

当草坪修剪较低时，发病草坪有多个圆形、凹陷、漂白色和稻草色小斑块，2～15 cm大小，如钱币般。发病严重时，相邻的数个病斑汇合后可形成更大的不规则形状的病斑。单株植株染病时，由叶尖开始向下枯萎，叶片首先出现水浸状褪绿斑，随后叶片变褐枯黄，从叶尖开始由上而下卷曲，病斑边缘通常会环绕一圈红褐色条带，接着整个叶片迅速枯萎死亡。病斑内叶片多同时枯萎形成凹陷的枯草斑，在雨后，或低温湿润的天气，检查带有露水的叶片，常常可以观察到白色、蛛网状气生菌丝（图1A，B，D）。当草坪修剪不够频繁或不修剪时，币斑病菌也可从叶缘和中部侵染叶片，造成从叶片变褐枯萎。在这种情形下，发病草坪并不能形成典型的钱币状病斑，这时候诊断就较为困难，但通常叶片的病斑边缘也会形成一圈红褐色条带（图1C）。

2．2 致病性测定

2．2．1 离体叶片菌饼接种 地毯草离体叶片菌饼接种4 d后，叶片大部分面积变褐枯黄，形成水浸状褪绿斑，气生菌丝覆盖于叶片之上，病斑边缘有明显的红褐色水浸状条带。草坪草叶片均表现出与大田草坪上相似的症状，并且所有病组织经过分离后均得到了与接种体相同的病原菌（图2A）。

2．2．2 盆栽菌饼接种 分离物回接海滨雀稗、杂交狗牙根与结缕草盆栽植株的结果表明，该病原真菌导致植株产生与田间症状一致的病变：接种2～3 d后可观察到白色絮状菌丝散发开来缠绕叶片，接种4～5 d叶片开始出现水浸状的褪绿斑，接种10 d后叶片枯黄变褐、枯萎死亡，对显症植株采用组织分离法进行再分离，所得分离物与接种菌株一致（图2B，C，D）。

2．3 病原菌鉴定

2．3．1 形态学特征和培养性状 在PDA培养基上培养首先形成大量向上簇生的、白色絮状气生菌丝，25℃黑暗条件下，3～4 d即可长满一皿；培养7～14 d菌丝集结，菌落逐渐变得致密，部分气生菌丝开始塌陷。菌落表面逐渐由白色变为淡褐色、淡黄色（图3A，B）。2～3周后，菌落呈现紧实的垫状或片状，菌丝下层产生片状或垫状的黑色子座组织。随着不断吸收周围菌丝，子座组织厚度增加，颜色变深（深褐色至黑色），体积增大，最终可占据大部分菌落（图3C，D）。

2．3．2 病原菌的分子鉴定 对4个币斑病病原菌菌株ML7-3、TD-C-1、HD8-1、HE-1的r DNA-ITS序列进行扩增后，将PCR产物纯化后测序，测序分别获得580 bp左右的r DNA-ITS序列片段，与期望片段大小相符。本研究已将4个币斑病病菌r DNA-ITS序列提交到Gen-Bank（登录号分别为ML7-3：KF048089；TD-C-1：KF048091；HE-1：KF048090；HD8-1：KF048088）。

利用NCBI网站中的BLAST软件，对所测菌株的序列进行同源性比对：4个菌株与多个币斑病病原菌S. homoeoparpa的同源性均达到了97%～100%。辅助证明海滨雀稗与结缕草币斑病主要致病菌是S.homoeoparpa。从构建的系统发育树可以看出，分离自中国海南省的币斑病菌株和世界各地的币斑病聚在同一分类单元，而与三叶草核盘病菌（Sclerotinia trifoliorum）和油菜核盘病菌（Sclerotinia sclerotiorum）不能聚在一个分支，从而证明从海南省分离的菌株是币斑病病菌（S.homoeoparpa）（图4）。

2．4 病原物生物学特性

2．4．1 温度对菌丝生长的影响 由图5可知，病原菌各菌株菌丝在5～35℃下均能生长，适宜生长温度为20～30℃，最适生长温度为28℃，40℃停止生长。

2．4．2 p H值对菌丝生长的影响 各菌株菌丝在p H值为4～10时均可生长，p H值为4～7时各菌株生长状况较好，其中p H值为5时生长状况最佳。总体来看，偏酸性的环境条件下有利于菌丝的生长（图6）。

2．4．3 菌丝致死温度的测定 35～45℃处理10 min后，各菌落全部生长正常；在50℃处理后，部分菌落不再生长，且能够生长的菌落生长速率明显小于低温处理；55℃处理后，所有菌落均完全停止生长。结果说明，各菌株菌丝的致死温度均为55℃／10 min（表1）。

2．4．4 光照对菌丝生长的影响 各菌株菌丝在全光照处理下生长最快，在黑暗条件下生长最慢。菌株HD8-1菌丝生长速度在3种处理下差异显著（P＜0．05）。光照相对于光暗交替更有利于菌丝的生长（表2）。

2．4．5 碳源对菌丝生长的影响 在供试的10种碳源中，以可溶性淀粉为碳源的培养基最适合各菌株生长，其次是以纤维二糖为碳源的培养基。在以D-甘露醇和D-阿拉伯糖为碳源的培养基中生长最慢（图7）。

2．4．6 氮源对菌丝生长的影响 在供试的8种氮源中，病原菌对硝酸铵、磷酸二氢铵的利用效果最佳，其次是硝酸钾和蛋白胨。而在含脲的培养基上生长最慢（图8）。

3 讨论

通过对病害症状的系统观察，病菌的形态学、培养性状和分子特征比较研究以及病原菌致病性测定，结合国内外有关研究资料，结果表明，4种暖季型草坪草海滨雀稗、杂交狗牙根、结缕草、地毯草币斑病病原均为S.homoeoparpa。

草坪币斑病在全世界各地都有发生［14，17］，并可严重危害禾本科在内的多种植物。在我国，Lv等［12-13］已报道币斑病可危害我国各地多种草坪草，其中包括海滨雀稗、剪股颖（Agrostis matsumurae）、草地草熟禾（Poa pratensis）、高羊茅（Festuca elata）、结缕草。本研究首次报道币斑病可危害我国海南省的4种暖季型草坪草，其中币斑病菌危害杂交狗牙根和地毯草是在我国的首次报道。币斑病已在我国成为主要的草坪病害之一，因此，币斑病在我国的分布、寄主范围、危害程度还有待于进一步的调查研究。

币斑病的典型症状是在草坪上形成约钱币大小的枯草病斑。然而，笔者发现，在不同的修剪情况下，其症状略有不同。在修剪高度较低的高尔夫球场果岭、球道等草坪上，病斑呈圆形、凹陷、直径较小的稻草色。而在家用、绿地草坪等留茬较高的草坪上，可形成直径较大的不规则枯草斑，有时病菌也可从单个叶片的叶缘和中部侵染叶片，造成单个叶片变褐枯萎。当币斑病危害草坪并未形成典型的币斑状病斑时诊断就较为困难，易与红丝病和褐斑病等草坪病害混淆。但币斑病菌危害草坪时通常会在叶片病斑边缘形成环绕一圈红褐色条带，这也是币斑病危害的重要特征之一。

海南省草坪币斑病病原菌生物学特性的研究表明：病原菌最适生长温度为28℃，略低于吕晨辰［18］报道的南方币斑病菌株最适生长温度31℃［18］。该病原菌对酸碱度的适应能力较强，在p H值为4～10的条件下都能较好的生长，偏酸性的条件有利于菌丝的生长，这与吕晨辰［16］报道的南方菌株最适p H值为5～6基本一致。该菌对供试的10种碳源和8种氮源有一定的选择性，可溶性淀粉和硝酸铵分别是最佳碳源和最佳氮源，研究还发现，在不加碳源和氮源的培养基中，菌丝虽然能生长，但菌丝稀疏，说明碳源和氮源对草坪币斑病病菌的生长起着重要的作用。

币斑病是危害草坪的重要病害，国外已经做了许多关于币斑病防治的相关研究，其中包括利用优良抗耐病品种［19-21］，配合生态［22-24］和生物防治［25-28］，采取有效的化学防治［29-31］以达到防治效果。我国应借鉴国外研究成果与经验，根据当地气候环境条件，制定合理的币斑防治措施，以实现草坪草币斑病的综合治理。

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Identification and characterisation of Sclerotinia homoeoparpa causing leaf blight in 4 warm-season turfgrass species

ZHANG Wu1，LIU Guodao2，NAN Zhibiao1*
1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology；State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China；2.Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Utilization，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China

This paper reports on field disease surveys carried out at several golf courses and college lawns in Hainan Province from 2011 to 2013．A serious disease similar to Dollar Spot was observed which affected 4 common warm-season turfgrass species．Based on comprehensive analyses including Koch’s postulates tests，the identification of morphological characteristics and r DNA－ITS sequencing，the pathogen causing Dollar Spot disease in Hainan province was identified as Sclerotinia homoeocarpa．To our knowledge，this is the first report that S.homoeocarpa can cause Dollar Spot in Burmudagrass and Carpetgrass in China．Biological characteristics analysis showed that S.homoeocarpa grew well in conditions where the temperature ranged from 25－30℃and p H from 5－7．The optimum growth conditions were 28℃and p H 5．Hyphallost their viability in agar plugs that were incubated at 55℃for 10 minutes．Light promoted mycelium growth and all the tested carbon and nitrogen sources were utilized by S.homoeocarpa．Soluble starch had higher usage efficiency for mycelium growth than the other carbon sources，whereas D-mannitol and D-arabinose had lower usage efficien-cy．Ammonium nitrate and ammonium dihydrogen phosphate had higher usage efficiency for mycelium growth than the other nitrogen sources，whereas carbamide had lower usage efficiency．

warm-season turfgrass；Dollar Spot；Sclerotinia homoeocarpa；biological characteristics

10．11686／cyxb20150116 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

章武，刘国道，南志标．4种暖季型草坪草币斑病病原菌鉴定及其生物学特性．草业学报，2015，24（1）：124-131．

Zhang W，Liu G D，Nan Z B．Identification and characterisation of Sclerotinia homoeoparpa causing leaf blight in 4 warm-season turfgrass species．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：124-131．

2013-05-06；改回日期：2014-03-19

国家公益性行业农业科技专项（201303057）和国家973计划项目（2014CB138702）资助。

章武（1987-），男，江西抚州人，在读博士。E-mail：ldzw1987＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：zhibiao＠lzu．edu．cn