陈江生 李志祥 宋明浩 凌毕益

深圳市宝安区松岗人民医院神经外科，广东深圳 518105

创伤性脑损伤是45 岁以下成年人致死和致残的重要原因，创伤性脑损伤不仅会让大多数患者遗留不同程度的残疾，同时也给社会和家庭带来沉重的社会和经济负担。氧自由基损伤是影响创伤性脑损伤预后极其重要的一个影响因素，而葛根素为一个有效的氧自由基清除剂，因此本实验构建创伤性脑损伤动物模型，并且以葛根素干预，以探讨葛根素是否具有创性脑损伤保护作用。

1 材料与方法

1.1 模型制作

选择健康成年雄性SD 大鼠40 只[由广东省医学实验动物中心提供， 实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2013 ～0002]，体 重250~300g。根 据Brody 等建立的定量脑皮质挫伤（controlled cortical impact injury，CCI）方法[1]构建脑损伤的模型，具体操作为：实验前大鼠需禁食12h。首先大鼠经2% 50mg/kg 戊巴比妥腹腔注射麻醉后，选择仰卧位于立体定向头架上，无菌条件下在中线将头皮切开，将骨膜剥离，暴露出右顶骨。矢状缝中线旁开2.5mm，在人字缝与冠状缝中钻一直径为5mm 骨孔，暴露出硬脑膜。于脑立体定位仪上安装电磁颅脑损伤撞击器的传动装置，经使用脑立体定位仪操纵臂使撞击头与鼠头矢状面呈80°，与冠状面平行呈垂直在大鼠硬脑膜上固定，使硬脑膜与撞击头末端相垂直。经撞击器设置，用5mm 直径的撞击头，且以3m/s 速度，2mm 打击深度，120ms 打击时间中制作中度创伤性脑损伤。创伤性脑损伤后应立即将撞击器移除，后缝合头皮切口。在出现自主呼吸恢复后，大鼠重新进入饲养笼，行损伤后观察，假手术大鼠手术与麻醉程序同上，但无冲击损伤过程。对于葛根素治疗组的大鼠，在CCI 模型制作后15min，腹腔注射葛根素（60mg/kg）。

1.2 实验分组

将SD 大鼠分为四组：损伤组（A 组）和假手术组（B 组），葛根素治疗的损伤组（C 组）和葛根素治疗的假手术组（D 组）。A 组大鼠进接收CCI 模型，B 组大鼠为假手术组，作为阴性对照，C 组大鼠为CCI 模型合并葛根素治疗，作为葛根素治疗组，而D组大鼠为假手术组合并葛根素治疗，作为本底对照组。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 神经功能缺损评分（mNSS） 采用改良的神经功能缺损评分（mNSS）（表1）对四组动物创伤性脑损伤后7d 神经功能损伤情况进行评价。经mNSS 评分，包括肢体运动、感觉、翻身、平衡与协调，为0~18 分，分数越高则神经功能缺损越严重。

表1 改良的神经功能缺损评分

1.3.2 脑组织干湿重比 采用干湿重称量法得出四组试验动物损伤24h 后脑组织含水量，具体操作：先将脑组织取样，用甲醛固定后，称取重量，然后将脑组织在真空条件下60℃烘干，24h 后，称重；同样方法测的损伤后脊髓的重量。含水量=（脑湿重－脑干重 ）/脑干重。

1.3.3 脑组织MDA 含量 SD 大鼠断颈处死后，迅速取出大脑，用冰冷的pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）制备10%脑匀浆，离心后取上清液进行受损侧脑组织中MDA 含量，测定步骤按试剂盒说明书进行，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 葛根素对大鼠创伤性脑损伤的神经功能的影响

在创伤性脑损伤模型中（TBI）后，两组均出现了明显的神经功能缺损，而葛根素能明显减轻神经功能缺损，两组比较差异有统计学意义（t=3.09，P=0.013）。见图1。

图1 神经功能缺损评分。 与创伤性脑损伤组相比（B组），*P＜0.05

2.2 葛根素对大鼠创伤性脑损伤后脑组织水肿的影响

假手术组中大鼠脑组织干湿重比无差异，且未出现脑水肿。而在创伤性脑损伤后，大鼠脑组织的干湿重比明显增高，而与B 组相比，给以葛根素治疗组（C 组）的干湿重比显著降低（t=8.01，P=0.000）。见图2。

图2 脑组织干湿重比。与创伤性脑损伤组相比（B 组），*P ＜0.05

2.3 葛根素对创伤性脑损伤后脑组织氧化应激产物MDA含量的影响

创伤性脑损伤后，B 组和C 组脑组织的氧化应激产物MDA 含量均显著升高（t1=10.7，P1=0.000；t2=9.85，P2=0.000）。而与B 组相比，葛根素能显著减少MDA 含量的升高程度（t=6.43，P=0.002）。见图3。

图3 脑组织中MDA 水平。与创伤性脑损伤组相比（B组），*P<0.05，与假手术组相比（A 组），#P<0.05

3 讨论

迄今为止，尚无经FDA 批准的用于治疗急性创伤性脑损伤的药物上市。而目前对于急性创伤性脑损伤的治疗多是基于缓解脑损伤的一些辅助治疗方法，例如脱水、减轻血管痉挛等。而引起创伤性脑损伤进展的因素既包括初次外伤引起的脑组织的，也包括继发性的脑水肿、脑缺血、炎性反应、氧化应激反应等病理生理机制引起的二次脑损伤[2-3]。而氧自由基的堆积被认为是创伤性脑损伤病理生理过程中极其重要的一个因素。氧化应激（oxidative stress，OS）是体内产生大量氧自由基所介导的一种反应，导致机体氧化/抗氧化系统失衡从而造成组织损伤，并认为其失衡是导致衰老和疾病的一个重要因素之一。因而，维持氧化与抗氧化系统的平衡，可以有效地对抗氧化应激损伤[4-6]。

葛根素（Puerarin）是从豆科植物葛的根中提取的一种异黄酮成分，是一种天然的抗氧化剂，能有效的清除氧自由基，对多种氧化应激损伤具有保护作用，例如对心肌缺血、心肌缺血再灌注损伤和对老年痴呆也有保护作用[7-8]。近来发现葛根素对神经系统疾病也具有保护作用，例如中风和蛛网膜下腔出血[9-10]。在此项实验中，我们发现葛根素能有效减轻创伤性脑损伤动物模型中的神经功能缺损、脑水肿情况，也能显著减少因氧化应激损伤造成的氧化应激MDA 活性的升高程度。

基于目前的研究，葛根素的抗氧化机制也是非常复杂[11]。有研究表明葛根素能显著减少eNOS 蛋白和基因的表达，从而减轻氧化应激损伤，减轻心肌的缺血性损伤，这一保护作用可能由PI3K/AKT信号通路介导[12]。同时，葛根素也能通过cAMP 和cGMP 信号通路减轻Ca2+内流，从而起到抗血管收缩的作用。

虽然本实验发现了葛根素能有效的减轻创伤性脑损伤的神经功能缺失和脑水肿，并能提高抗氧化酶SOD 的活性，但是对于其具体作用机制尚未阐明。有文献表明创伤性脑损伤的氧化应激损伤与Nrf2-ARE 通路密切相关[13]，是否葛根素是通过这一信号通路起作用需要进一步实验进行证明。

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