卫功庆，刘少华，范 宁，李 梁，赵 岩，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春130118)

响应曲面法优化鹿角盘胶原蛋白酶解提取工艺研究

卫功庆，刘少华，范 宁，李 梁，赵 岩，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春130118)

【目的】 采用响应曲面法对鹿角盘胶原蛋白酶解提取工艺进行优化。【方法】 以马鹿鹿角盘为原料，胶原蛋白提取率为指标，选取料液比、pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间5个因素进行单因素试验，确定各因素的最优提取条件。在单因素试验的基础上，选取pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间为影响因素，进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，采用响应曲面法分析4个因素对胶原蛋白提取率的影响。【结果】 单因素试验结果表明：料液比1∶20、pH值1.8、加酶量4%、酶解温度37 ℃、酶解时间为6 h时胶原蛋白提取率最高。响应曲面法得到的最佳提取工艺为：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解温度36.78 ℃、酶解时间5.39 h，考虑到实际情况，对模型预测得到的马鹿鹿角盘胶原蛋白最优提取工艺进行修正，修正后的工艺为：pH 1.8、加酶量4%、酶解温度37 ℃、酶解时间5 h。在此条件下，马鹿鹿角盘胶原蛋白提取率达到83.32%。4个因素对胶原蛋白提取率影响的重要性顺序为：酶解温度>加酶量>pH值>酶解时间。【结论】 建立了酶解法提取鹿角盘胶原蛋白的二次多项式模型，获得了胶原蛋白提取率较高的最佳工艺参数，有效缩短了胶原蛋白的提取时间。

响应曲面法；马鹿鹿角盘；胶原蛋白；提取工艺优化；胃蛋白酶

鹿角盘是雄性鹿科动物马鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)在每年7～8月份鹿茸被割下以后自然生长出来的形状不一、十分坚硬的盘状物质，待到第二年的4～5月份自然脱落[1]。鹿角盘中含有大量的胶原蛋白，是鹿角霜、鹿角胶的原料[2]。《中国药典:2010版一部》明确规定，鹿角为鹿科动物马鹿或梅花鹿已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基[3]。据《神农本草经》记载，鹿角盘具有温补肝肾、活血消肿、治阴症疮疡、乳痈初起、淤血肿痛等功效。马鹿角有补肾阳、益精血和抗疲劳及增强机体免疫能力的作用，另外马鹿茸、马鹿骨为可用于保健食品的生物资源[4]。新疆马鹿角已被应用于“骨密钙”等钙补充剂产品中，发挥其增强骨密度的功能和作用，由新疆特丰药业利用天山马鹿角研发出的防治骨质疏松新产品“骨密钙”已投入市场[5]。研究表明，马鹿角蛋白酶解物具有抗氧化、抗疲劳和提高免疫功能的作用[6]。

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，占动物体内总蛋白的25%～30%，占骨骼有机物的80%以上[7]。胶原蛋白具有很强的伸张能力，具有增加肌肤弹性、增强机体皮肤组织细胞储水能力以及保持皮肤细嫩、柔软等生理功能[8]。胶原蛋白中甘氨酸的含量约占1/3；一般来说，羟脯氨酸约占胶原蛋白干质量的14%左右，但随组织来源、部位甚至测定方法不同其含量有所不同，如软骨中约占10%；羟脯氨酸是胶原蛋白中的特征性氨基酸，胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸含量共约占1/4，而且胶原蛋白中存在其他蛋白质中没有的羟基赖氨酸(Hyl)[9]。胶原蛋白广泛存在于动物的韧带、肌鞘、骨、软骨、肌腱、皮肤和筋膜中，其提取制品已广泛应用于化妆品、食品、医药、保健品等众多领域[10]。目前，胶原蛋白的提取方法主要有酸法、碱法、盐法、酶法、热水浸提法等。与酸法、碱法相比，酶法能保存原料中的有效成分，具有专一性强、反应条件温和、反应速度快、无氨基酸破坏或消旋现象、没有有害物质及副产物产生，酶解过程可控等优点，且酶解得到的产物游离氨基酸较少、多肽较多，安全性高[11]。但是，由于鹿角盘是鹿茸骨化后的产物，质地非常坚硬，不易粉碎，使鹿角盘有效成分的提取、分离较为困难，直接影响了人们对它的深入研究，因此市场上关于鹿角盘的加工制品较为罕见。为此，本试验以马鹿鹿角盘为原料，采用响应曲面法对酶解法提取鹿角盘胶原蛋白的工艺进行优化研究，以期为鹿科动物产品的综合开发和深度利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马鹿鹿角盘购于辽宁省清原县；胃蛋白酶(1∶3 000)、对二甲氨基苯甲醛、L-羟脯氨酸，均购于国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸、浓盐酸、氯胺T、高氯酸、异丙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TG628A分析电子天平，上海皖衡电子仪器有限公司生产；UV-1800紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司生产；PHS-W系列微机型pH计，上海般特仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅，北京国华医疗器械厂生产；SHA-C数显水浴恒温振荡器，金坛市江南仪器厂生产；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司生产；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品。

1.3 鹿角盘粉常规成分的测定

水分测定：直接干燥法(GB 5009.3-2010)；灰分测定：马福炉法(GB 5009.4-2010)；粗蛋白测定：凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)；脂肪测定：索氏抽提法(GB 5009.6-2003)。

1.4 羟脯氨酸标准曲线的建立

按照文献[12]的方法建立羟脯氨酸标准曲线。

1.5 鹿角盘中胶原蛋白含量的测定

准确称取马鹿鹿角盘粉100 mg至酸解管中，加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，抽真空充氮气，重复3次后，在充氮气状态下拧紧螺丝盖，将已封口的酸解管放在恒温干燥箱内110 ℃酸解24 h，然后取出冷却、过滤，将滤液转移至蒸发皿中，水浴蒸发除去剩余的盐酸，将样品移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混合均匀，即得样品酸解液。吸取样品酸解液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，混合均匀，即得样品稀释液。吸取样品稀释液1 mL，采用对二甲氨基苯甲醛比色法，在558 nm处测定吸光度。通过羟脯氨酸标准曲线换算出样品酸解液中羟脯氨酸的质量浓度，再乘以相应的系数即可转换为鹿角盘中胶原蛋白的含量。

样品中胶原蛋白含量的计算公式：

w1=(C1×V1×F1)/(m1×106)×H×100%。

(1)

式中：w1为样品中胶原蛋白的含量(%)；C1为样品酸解液中羟脯氨酸的质量浓度(μg/mL)；V1为样品酸解液的总体积(mL)；F1为样品酸解液的稀释倍数；H为羟脯氨酸转换为胶原蛋白的系数，取7.1[13]；m1为样品的质量(g)。

1.6 鹿角盘胶原蛋白酶解法提取工艺的优化

1.6.1 鹿角盘的酶解工艺 将马鹿鹿角盘粉碎(过0.15 mm孔径筛)、脱钙，取脱钙后的马鹿鹿角盘粉与0.5 mol/L乙酸按一定比例混合，调节体系pH值，然后加入一定量的胃蛋白酶，置于数显水浴恒温振荡器中，在适宜温度下反应一定时间进行酶解，反应结束后100 ℃灭酶活10 min，双层滤纸抽滤，得到酶促酸溶胶原蛋白(PSC)酶解液，冷冻干燥，得到酶促酸溶胶原蛋白(PSC)粉。

1.6.2 鹿角盘胶原蛋白酶解工艺的单因素试验 选取料液比(即原料质量(g)与0.5 mol/L乙酸体积(mL)比)、pH值、加酶量(胃蛋白酶质量与原料质量比(%))、酶解温度和酶解时间5个单因素为考察因子，胶原蛋白提取率为考察指标，进行单因素试验。

1) 料液比的确定。称取脱钙后的马鹿鹿角盘粉1 g(精确到0.000 1 g)，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30加入0.5 mol/L乙酸，调节pH值至2，加酶量4%，酶解温度37 ℃，酶解时间6 h，100 ℃灭酶活10 min，测定提取液中的胶原蛋白含量。

2) pH值的确定。称取脱钙后的马鹿鹿角盘粉1 g(精确到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，调节pH值分别为1.4，1.6，1.8，2.0和2.2，加酶量4%，酶解温度为37 ℃，酶解时间6 h，100 ℃灭酶活10 min，测定提取液中的胶原蛋白含量。

3) 加酶量的确定。称取脱钙后的马鹿鹿角盘粉1 g(精确到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，调节pH值至1.8，加酶量分别为1%，2%，3%，4%和5%，酶解温度37 ℃，酶解时间6 h，100 ℃灭酶活10 min，测定提取液中的胶原蛋白含量。

4) 酶解温度的确定。称取脱钙后的马鹿鹿角盘粉1 g(精确到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，调节pH值为1.8，加酶量4%，酶解温度分别为31，33，35，37和39 ℃，酶解时间6 h，100 ℃灭酶活10 min，测定提取液中的胶原蛋白含量。

5) 酶解时间的确定。称取脱钙后的马鹿鹿角盘粉1 g(精确到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，调节pH值为1.8，加酶量4%，酶解温度37 ℃，酶解时间分别为2，4，6，8和10 h，100 ℃灭酶活10 min，测定提取液中的胶原蛋白含量。

1.6.3 鹿角盘胶原蛋白酶解提取工艺的响应曲面法优化 通过响应面分析法和中心组合试验设计，利用Design-Expert软件进行数据分析，在单因素试验基础上进行响应曲面试验，以胶原蛋白提取率为评价指标，确定胃蛋白酶提取鹿角盘胶原蛋白的最优工艺条件，由于胶原蛋白提取率随料液比变化趋势缓慢，因此选取pH值(A)、加酶量(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)4个因素(表1)，进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，采用响应曲面法分析其对胶原蛋白提取率的影响。

1.6.4 提取液中胶原蛋白含量的测定 取1 mL马鹿鹿角盘胶原蛋白酶解提取液至酸解管中，加入9 mL 6 mol/L盐酸进行酸解后，在558 nm处测定样品的吸光度。通过羟脯氨酸标准曲线换算出酶解液中羟脯氨酸的质量浓度，再乘以相应的系数即可转换为提取液中胶原蛋白的含量。

酶解液中胶原蛋白含量的计算公式：

(2)

式中：w2为马鹿鹿角盘粉胶原蛋白酶解液中胶原蛋白的含量(%)；C2为马鹿鹿角盘粉胶原蛋白酶解液中羟脯氨酸的质量浓度(μg/mL)；V2为马鹿鹿角盘粉胶原蛋白酶解液的总体积(mL)；F2为马鹿鹿角盘粉胶原蛋白酶解液的稀释倍数；m2为马鹿鹿角盘粉胶原蛋白酶解液的质量(g)。

胶原蛋白提取率的计算公式：

w=w2/w1×100%。

(3)

1.7 验证试验

称取10 g(精确到0.000 1 g)脱钙后的马鹿鹿角盘粉3份，按照实际优化的工艺条件进行3次平行试验，按照1.6.4的方法测定马鹿鹿角盘中胶原蛋白的提取率。

1.8 数据统计

数据统计处理及图表绘制采用Excel 2003及Design-Expert 8.0.4软件。

2 结果与分析

2.1 马鹿鹿角盘粉中常规成分的含量

马鹿鹿角盘粉中，水分含量占2.25%，灰分含量占55.05%，脂肪含量占0.20%；粗蛋白含量占41.23%，其中胶原蛋白含量为23.06%，占粗蛋白的55.93%，可见，马鹿鹿角盘是获取天然胶原蛋白的一条新途径。

2.2 羟脯氨酸标准曲线

以羟脯氨酸质量浓度为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，结果如图1所示。

由图1可知，吸光度值与羟脯氨酸质量浓度的关系为：y=0.086 8x+0.002，R2=0.999 3。

2.3 5个单因素对鹿角盘胶原蛋白提取率的影响

2.3.1 料液比的确定 由图2可以看出，当料液比为1∶20时，胶原蛋白的提取率达到最大值，为81.34%，继续增大0.5 mol/L乙酸的用量时，胶原蛋白提取率变化幅度较小，趋于平缓，从节约成本及降低后续浓缩负荷考虑，确定最适料液比为1∶20。

2.3.2 pH值的确定 由图3可以看出，在酶解时间及酶解温度一定的情况下，当 pH值达到1.8时胶原蛋白的提取率达到最大值，为87.10%。当继续升高pH值时，胶原蛋白的提取率反而下降，这可能是由于pH值升高导致酶活性降低，进而导致胶原蛋白的提取率下降，由此可以确定最适pH值为1.8。

2.3.3 加酶量的确定 由图4可以看出，胶原蛋白的提取率随着胃蛋白酶用量的增加而升高，在胃蛋白酶用量较小的情况下，胶原蛋白提取率相对较低，这可能是因为低浓度的酶在高浓度的底物中处于饱和状态。当加酶量超过4%时，胶原蛋白提取率的增加幅度不大，由于酶的价格相对较高，考虑到节约成本问题，确定最适加酶量为4%。

2.3.4 酶解温度的确定 由图5可以看出，随着酶解温度的升高，胶原蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势，当酶解温度为37 ℃时，胶原蛋白提取率达到最大，为85.26%，因此确定最佳酶解温度为37 ℃。

2.3.5 酶解时间的确定 由图6可以看出，当酶解时间在2～4 h时，胶原蛋白提取率相对较低，这可能是由于酶解时间过短，胶原蛋白未能充分释放到提取液中。当酶解时间为6 h时胶原蛋白提取率达到最大，为82.63%；继续延长酶解时间，胶原蛋白提取率降低，这可能是由于随着酶解时间的延长，胶原蛋白过度水解，从而产生过多的苦味小分子低聚肽和氨基酸，进而导致胶原蛋白的流失。因此确定最佳酶解时间为6 h。

图5 酶解温度对鹿角盘胶原蛋白提取率的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on collagen yield from antler base

图6 酶解时间对鹿角盘胶原蛋白提取率的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis time on collagen yield from antler base

2.4 响应曲面法对马鹿鹿角盘胶原蛋白提取工艺的优化

选取pH值(A)、加酶量(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)4个因素，以马鹿鹿角盘胶原蛋白提取率(w)作为评价指标对工艺参数进行优化，设计方案及结果如表2所示。

在以上29个试验中，7、11、17、25、29是中心试验，重复5次试验来估计试验误差。利用Design Expert软件对29个试验进行回归分析，结果如表3所示。

利用Design Expert 软件，进行多元回归拟合，获得鹿角盘胶原蛋白提取率对编码自变量pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间的二次多项回归方程为：

由表3可知，模型的P<0.000 1，表示该模型对试验结果的模拟较好；失拟项的P值为0.074 3，失拟项不显著；说明可以用该模型对鹿角盘胶原蛋白提取工艺结果进行分析和预测。

由表3可知，各因素之间的交互作用对胶原蛋白提取率影响的主次顺序为：x1x2>x2x4>x1x4>x2x3>x1x3>x3x4，其中x1x2、x2x4、x1x4之间的交互作用影响达极显著水平，x2x3之间的交互作用达显著水平，x1x3、x3x4之间的交互作用未达显著水平，故不做详细分析。

在回归模型方差分析结果的基础上，根据得到的回归二次方程，利用 Design Expert软件绘制pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间对胶原蛋白提取率影响的响应曲面图(图7和图8)，对影响胶原蛋白提取率各因素效应进行响应面分析。

(1)主效应分析。根据各因素的显著性检验结果(表3)，可得出4因素对胶原蛋白提取率的影响主次顺序依次为：酶解温度>加酶量>pH值>酶解时间，酶解温度、加酶量、pH值和酶解时间对胶原蛋白提取率的影响均达极显著水平。

(2)两因素之间的交互效应分析。由表3可知，x1x2、x1x4、x2x4、x2x3的P值均小于0.05，即pH值和加酶量、pH值和酶解时间、加酶量和酶解时间、加酶量和酶解温度之间的交互作用对胶原蛋白提取率的影响显著，其响应面图与等高线图如图7和图8所示。

等高线的形状可以反映交互项影响的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。综合图7、图8响应面图与等高线图可以看出，当pH值一定时，胶原蛋白提取率随加酶量的增加及酶解时间的延长呈先升高后降低的趋势；当加酶量一定时，胶原蛋白提取率随pH值及酶解温度的升高、酶解时间的延长呈先升高后降低的趋势；当酶解温度一定时，胶原蛋白提取率随加酶量的增加呈先升高后降低的趋势；当酶解时间一定时，胶原蛋白提取率随pH值的升高及加酶量的增加呈先升高后降低的趋势；说明响应面优化设计能够较好地反映试验所设定的4个因素对胶原蛋白提取率的影响，对各因素的考察较为系统、全面，试验结果具有一定的应用价值。

为确定最佳酶解工艺参数，对所得方程进行逐步回归，删除不显著项，然后求一阶偏导，并令其为0，可得胶原蛋白提取率达到最大值时的工艺条件为：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解温度36.78 ℃、酶解时间 5.39 h；考虑到实际情况，将其优化后的条件修正为，pH 1.8、加酶量4%、酶解温度37 ℃、酶解时间5 h。

注：**、*分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。x1、x2、x3、x4分别代表因素A、B、C、D。

Note:“**” and “*” mean significant difference atP<0.01 andP<0.05 respectively.x1,x2,x3,andx4indicate A,B,C,and D respectively.

图7 pH值和加酶量的交互作用对鹿角盘胶原蛋白酶解提取率的影响
Fig.7 Interaction between pH and enzyme loading on the extraction rate of enzymatic hydrolysis of collagen from antler base

2.5 验证试验

按照实际优化的工艺条件(pH 1.8、加酶量4%、酶解温度37 ℃、酶解时间5 h)进行试验，得到鹿角盘胶原蛋白提取率为83.32%，与预测值基本一致，说明通过响应曲面法预测得到的优化工艺参数准确、可靠，具有一定的实用价值。

3 讨论与结论

随着生活水平的提高，人们追求健康的意识逐渐加强，胶原蛋白的美容、保健功效越来越受到人们的青睐。胶原蛋白是鹿角盘中的主要功效成分之一，从鹿角盘中提取胶原蛋白是获取天然胶原蛋白的一条新途径。鹿角盘中含有丰富的胶原蛋白及多肽，临床上，鹿角盘胶原蛋白具有治疗骨质疏松、乳腺增生等作用[14-16]。由于鹿角盘属于骨类，质地坚硬，从中提取胶原蛋白一般采用高温浸提或酒制的方法。粗提得到的胶原蛋白为明胶，低温放置仍具有凝胶性，分子量在几万到十万，不易被人体消化利用，因此需进行酶解，酶解得到的胶原蛋白分子量在几千到几万[17-19]。徐云凤等[20]采用水提与胰蛋白酶酶解相结合的方法提取鹿角盘胶原蛋白，得出鹿角盘胶原蛋白提取率为22.31%，其中的蛋白含量为66.32%。通过查阅相关文献得知：胃蛋白酶是一种消化性蛋白酶，它可以使胶原溶解，胃蛋白酶催化水解胶原的端肽非螺旋区，而对螺旋区无作用，这样溶解的胶原仍具有完整的三螺旋结构，降低了胶原的抗原性，具有良好的生物相容性，而乙酸可以起到使胶原蛋白膨胀和增溶的作用[21-22]。因此本试验采用乙酸与胃蛋白酶相结合的方法提取鹿角盘中的胶原蛋白。

响应曲面法已成功应用于优化酶催化反应的处理条件，如pH值、加酶量、酶解时间、酶解温度等。响应面分析法是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，在评估有效因素和数学模型等方面能够准确描述相互作用的各独立变量之间的相关关系，应用该方法求得的回归方程精度高，而且能研究几种因素间的交互作用。中心组合试验设计可采用较少的时间和试验次数，以最经济的方式对多因素多水平试验进行科学的、全面的研究[23-24]。李珂等[25]采用响应曲面法对骨胶原蛋白酶解条件进行了优化，得出骨粉多肽生成量为121.45 mg/g。张根生等[26]采用响应曲面法对碱性蛋白酶提取林蛙残体胶原蛋白的工艺进行了优化，得出林蛙残体胶原蛋白提取率为 55.38%。李莉等[27]采用响应面法优化酶法优化了大鲵皮胶原蛋白的提取工艺，得出大鲵皮胶原蛋白提取率可达到 66.99%。因此，利用响应面分析方法可以准确找出整个区域内因素的最佳组合以及获得胶原蛋白提取率的最优工艺参数。

本研究利用Design Expert软件，应用响应曲面法，对马鹿鹿角盘粉的胶原蛋白提取工艺进行了优化，得到的优化工艺参数为：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解温度36.78 ℃、酶解时间5.39 h。考虑到实际情况，将其优化为pH 1.8、加酶量4%、酶解温度37 ℃、酶解时间5 h，在此条件下，鹿角盘胶原蛋白的提取率达83.32%。在今后的试验过程中，将对鹿角盘胶原蛋白的分离、纯化、理化性质及其酶解产物生物活性进一步研究，也可以考虑采用复合酶对鹿角盘进行酶解。胶原多肽是胶原蛋白在细菌、酶或者化学的作用下分子链解体、断裂之后形成的介于蛋白质和氨基酸之间的产物，相对分子量从几千到几万，它比胶原蛋白更容易被消化吸收，并且在营养、功能特性等方面也有十分显著的提高。将胶原蛋白水解为胶原多肽可使其在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著的提高。因此，将胶原蛋白水解为胶原多肽为下一步研究的重点。

[1] Wu F F,Li H Q,Jin L J,et al.Deer antler base as a traditional Chinese medicine:A review of its traditional uses,chemistry and pharmacology [J].Journal of Ethnopharmacology,2013,145(2):403-415.

[2] 邓明鲁.中国动物药资源 [M].北京:中国中医药出版社,2007:323-325.

Deng M L.Source of pharmic animal [M].Beijing:China Press of Traditional Chinese Medicine,2007:323-325.(in Chinese)

[3] 国家药典委员会.中国药典：2010版一部 [M].北京:中国医药科技出版社,2010.

China Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopoeia 2010 edition [M].Beijing:China Medical Science Press,2010.(in Chinese)

[4] 秦 瑜,张明海.中国马鹿的研究现状及展望 [J].野生动物杂志,2009,30(2):100-104.

Qin Y,Zhang M H.Review of researches of red deer (Cervuselaphus)and perspects in China [J].Chinese Journal of Wildlife,2009,30(2):100-104.(in Chinese)

[5] 一 文.特丰药业用马鹿角制成防治骨质疏松药 [N].医药经济报,2008-04-28(9).

Yi W.Special Feng pharmaceutical used horses antlers made prevention osteoporosis drug [N].Medicine Economic News,2008-04-28(9).(in Chinese)

[6] 侯 潇,高 建,李春雨,等.马鹿角蛋白酶解物的抗氧化抗疲劳和免疫活性 [J].食品科学,2013,34(9):305-309.

Hou X,Gao J,Li C Y,et al.Antioxidant,anti-fatigue and immune function of antler (Cervuselaphus) protein and hydrolyzate [J].Food Sciences,2013,34(9):305-309.(in Chinese)

[7] 蒋挺大,张春萍.胶原蛋白 [M].北京:化学工业出版社,2006.

Jiang T D,Zhang C P.Collagen [M].Beijing:Chemical Industry Press,2006.(in Chinese)

[8] 宋 芹,陈封政,颜 军,等.胶原蛋白研究进展 [J].成都大学学报:自然科学版,2012,31(1):35-38.

Song Q,Chen F Z,Yan J,et al.Research advances of collagen [J].Journal of Chengdu University:Natural Science Edition,2012,31(1):35-38.(in Chinese)

[9] 白海英,柯蕾芬,朱文赫,等.胶原蛋白应用的研究进展 [J].吉林医药学院学报,2013,34(2):133-134.

Bai H Y,Ke L F,Zhu W H,et al.Research progress of collagen application [J].Journal of Jilin Medical College,2013,34(2):133-134.(in Chinese)

[10] Matthew D,Shoulders,Ronald T,et al.Collagen structure and stability [J].Annual Review of Biochemistry,2009,78:929-958.

[11] 高 健,李 强,吕 磊,等.马鹿角蛋白酶解工艺研究 [J].特产研究,2012,34(2):12-16.

Gao J,Li Q,Lü L,et al.Studies of enzymohydrilysis condition for the production of anlter protein inCervuselaphus[J].Special Wild Economic Animal and Plant Research,2012,34(2):12-16.(in Chinese)

[12] 蓝蔚青,王 川,李 燕,等.猪皮中羟脯氨酸含量的测定 [J].中国食物与营养,2006(10):38-40.

Lan W Q,Wang C,Li Y,et al.Determination of hydroxyproline in pig skin [J].Food and Nutrition in China,2006(10):38-40.(in Chinese)

[13] 李小勇.猪肺中胶原蛋白的提取及理化特性研究 [D].重庆：西南大学,2007.

Li X Y.Study on extraction and the physical and chemical properties of pork lung collagen [D].Chongqing:Southwest University,2007.(in Chinese)

[14] 刘 盟,马 玉,冯 崴,等.新疆马鹿角提取物对 MC3T3-E1成骨细胞 RANKL/OPG mRNA表达的影响 [J].中药新药与临床药理,2011,22(6):605-609.

Liu M,Ma Y,Feng W,et al.Invitroeffects of the extracts from the Xinjiang cornuCervielaphion RANKL/OPG mRNA expression in MC3T3-E1 osteoblasts [J].Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology,2011,22(6):605-609.(in Chinese)

[15] Dorothée D,Hervé B,Anne B,et al.Carbon and nitrogen isotopic composition of red deer (Cervuselaphus) collagen as a tool for tracking palaeo environmental change during the Late-Glacial and Early Holocene in the northern Jura (France) [J].Palaeogeography,Palaeoclimatology,Palaeoecology,2003,195(3/4):375-388.

[16] Gomez S,Garcia A J,Luna S,et al.Labeling studies on cortical bone formation in the antlers of red deer (Cervuselaphus) [J].Bone,2013,52(1):506-515.

[17] Li Y Q,Zhao Y,Tang R N,et al.Prevention and therapeutic effect of Sika Deer Velvet collagen hydrolysate on osteoporosis in ovariectomized rats [J].Natural Product Research and Development,2010,22:578-581.

[18] Takeshi N,Nobutaka S,Yasuhiro T,et al.Collagen from tendon of Yezo Sika deer (Cervusnipponyesoensis) as by-product [J].Food and Nutrition Sciences,2012,3:72-79.

[19] Byongtae J,Sungjin K,Sangmoo P,et al.Effect of antler grow-th period on the chemical composition of velvet antler in sika deer (Cervusnippon) [J].Mammalian Biology,2008,74(5):374-380.

[20] 徐云凤,赵 雨,张 鹤,等.酶解法制备鹿角盘胶原蛋白的工艺 [J].食品研究与开发,2011,32(1):13-16.

Xu Y F,Zhao Y,Zhang H,et al.Study on preparation technology of trypsin hydrolytic collagen from antler plate [J].Food Research and Development,2011,32(1):13-16.(in Chinese)

[21] 郑明强,李新文,仇宏伟,等.从鸡骨中提取骨胶原的酶解工艺研究 [J].烟台大学学报:自然科学与工程版,2010,23(2):161-164.

Zheng M Q,Li X W,Qiu H W,et al.The technology research of enzymatic extraction of collagen from poultry bone [J].Journal of Yantai University:Natural Science and Engineering Edition,2010,23(2):161-164.(in Chinese)

[22] 陈丽丽,程 丹,赵 利,等.乙酸与胃蛋白酶提取鳗鱼骨胶原蛋白工艺的研究 [J].食品科技,2011,36(4):163-166.

Chen L L,Cheng D,Zhao L,et al.The extraction of collagen from eel bone using acetic acid and pepsin [J].Food Science and Technology,2011,36(4):163-166.(in Chinese)

[23] Fang X B,Xie N N,Chen X E,et al.Optimization of antioxidant hydrolysate production from flying squid muscle protein using response surface methodology [J].Food and Bioproducts Processing,2012,90:676-682.

[24] Karina D M,Ana M R.Pilosof.Relative viscoelasticity of soy protein hydrolysate and polysaccharides mixtures at cooling conditions analyzed by response surface methodology [J].Food Hydrocolloids,2012,26:318-322.

[25] 李 珂,杨秀华,扈 麟,等.响应曲面法骨胶原蛋白酶解条件的优化 [J].食品科学,2009,30(7):135-140.

Li K,Yang X H,Hu L,et al.Optimization of enzymatic hydrolysis conditions of pig bone collagen by response surface methodology [J].Food Sciences,2009,30(7):135-140.(in Chinese)

[26] 张根生,范爱月,韩 冰,等.响应曲面法优化碱性蛋白酶提取林蛙残体胶原蛋白 [J].食品科学,2011,32(2):93-96.

Zhang G S,Fan A Y,Han B,et al.Response surface optimization of alkaline protease hydrolysis for collagen extraction fromRanaamurensisboulenger residue after oil extraction [J].Food Sciences,2011,32(2):93-96.(in Chinese)

[27] 李 莉,顾赛麒,王锡昌,等.响应面法优化酶法提取大鲵皮胶原蛋白工艺 [J].中国水产科学,2013,20(4):876-883.

Li L,Gu S Q,Wang X C,et al.Optimization of conditions for the extraction of pepsin-soluble collagen from the skin of Chinese giant salamander (Andriasdavid-ianus) [J].Journal of Fishery Sciences of China,2013,20(4):876-883.(in Chinese)

Optimization of extracting technology for enzymatic hydrolysis of collagen from antler base ofCervuselaphususing response surface methodology

WEI Gong-qing,LIU Shao-hua,FAN Ning,LI Liang,ZHAO Yan,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicineMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 Extracting technology of collagen from antler base ofCervuselaphuswas optimized using response surface methodology.【Method】 Taking antler base ofCervuselaphusas material and collagen extraction rate as index,the effects of material-liquid rate,pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time on collagen yield were investigated by single factor experiments and the optimal condition of each factor was determined.Then,a four-factor and three-level Box-Behnken design coupled with response surface analysis was carried out to investigate the effects of pH value,enzyme loading,hydrolysis temperature,and hydrolysis time on collagen extraction rate.【Result】 Single factor experiments showed that the highest extraction yield was obtained when material-liquid rate,pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time were 1∶20,1.8,4%,37 ℃ and 6 h,respectively.The optimal condition pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time were 1.77,3.94%,36.78 ℃ and 5.39 h determined by response surface methodology.Considering the actual situations,the obtained optimal extracting methods for collagen production from antler base had pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time of 1.8,4%,37 ℃,and 5 h.Under the optimal conditions,collagen extraction rate from antler base was 83.32%.The importance of four factors to the extraction of collagen was in the order of hydrolysis temperature>enzyme loading>pH value>hydrolysis time.【Conclusion】 The extracting technology of antler collagen with pepsin enzymatic hydrolysis was optimized.A quadratic regression equation model was established and the optimum procedure parameters of enzymatic hydrolysis of collagen were obtained,which effectively shortened extraction time.

response surface methodology;antler base ofCervuselaphus;collagen;optimization of extracting technology;pepsin

2013-12-23

吉林省农业产业技术体系项目(08sys-097)

卫功庆(1966-)，男，安徽六安人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事特种经济动物研究。E-mail:wgq6611@126.com

张连学(1955-)，男，吉林大安人，教授，博士，博士生导师，主要从事中药学研究。E-mail:zlx863@163.com

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.024

R284.2

A

1671-9387(2015)06-0205-10

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.024.html