张亮，钱智磊，陆磊，侯文洁，丁红梓，王洁

(南京市胸科医院，南京210029)



同时测定血浆INH、AcINH、RFP和PZA的高效液相色谱法建立及其在肺结核患者中的应用

张亮，钱智磊，陆磊，侯文洁，丁红梓，王洁

(南京市胸科医院，南京210029)

摘要：目的建立同时测定血浆异烟肼(INH)、乙酰异烟肼(AcINH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)的高效液相色谱法(HPLC)，并验证其在肺结核患者中的应用效果。方法HPLC色谱柱为Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈和磷酸二氢钾为流动相，柱温40 ℃，流速0.8~1.0 mL/min，进样体积20 μL。同时进样含INH、AcINH、RFP、PZA对照品的血浆，检验方法的专属性、线性关系、精密度和准确度、稳定性及回收率。取联合服用INH、乙胺丁醇、RFP和PZA的10例肺结核患者的血浆样本，采用上述HPLC测定INH、AcINH 、RFP和PZA的血药浓度。结果血浆样本中INH、AcINH、RFP和PZA各组分有较好的分离，互不干扰；在线性范围内与峰面积线性关系良好(r2>0.99)；日内、日间精密度均<10%；稳定性较好；回收率为80%~120%。肺结核患者中除1例AcINH和1例RFP血药浓度低于线性范围外，其余数据均在线性范围内。结论成功建立了同时测定血浆INH、AcINH、RFP、PZA的HPLC方法，该方法专属性好，样品处理简单，符合生物样品分析要求。

关键词：结核病；高效液相色谱法；异烟肼；利福平；吡嗪酰胺；乙酰异烟肼；血药浓度

结核病是一种在全世界范围内流行的传染性疾病，每年可导致百万患者死亡[1]。同时服用异烟肼(INH)、利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇是初治结核病的首选方案[2~4]，该方案在大部分患者中疗效较好。但是，少部分患者由于血中药物浓度过低而导致治疗失败。乙酰异烟肼(AcINH)是INH在肝脏内最主要的乙酰化代谢产物，根据乙酰化作用的差异分为快代谢型和慢代谢型[5]，不同代谢类型的治疗效果和不良反应不同。通过监测血液中AcINH浓度来判断其乙酰化的类型，并以此为依据调整INH的给药剂量，对增强疗效和降低不良反应具有重要意义[6]。目前分析血液中INH、RFP和PZA的研究大部分是含量分析[7~10]，不能反映血浆药物浓度，且多数方法只能同时分析一种或两种药物。2014年6月~2015年2月，我们建立了一种联合测定血浆INH、AcINH、RFP、PZA浓度的高效液相色谱法(HPLC)，并验证其在肺结核中的应用效果。

1材料

LC-20AB HPLC系统(检测器为SPD-M20A，岛津公司，日本)。INH对照品(批号：100578-200401，中国药品生物制品检定所)；AcINH对照品(批号：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc)；PZA对照品(批号：100178-200403，中国药品生物制品检定所)；RFP对照品(批号：130496-200702)。乙腈(Merck公司，德国)，为色谱纯；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司，中国)，三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，中国)，均为分析纯。病毒灭活冰冻空白血浆，南京红十字血液中心。

2同时检测血浆INH、AcINH、PZA、RFP的HPLC的建立

2.1色谱条件色谱柱：Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)，0.05 mol/L磷酸二氢钾(B)(pH 6)，梯度为A∶B=2∶98，1~7 min；7~9 min内变化为A∶B=65∶35，9~20 min；20~22 min内变化为A∶B=2∶98。淋洗时间27 min；柱温40 ℃；流速：1~7 min为0.8 mL/min，7~9 min为1 mL/min，9~20 min为1 mL/min，20~22 min为0.8 mL/min。进样体积20 μL；检测波长INH和AcINH为 261 nm，PZA 为268 nm，RFP 为340 nm。

2.2血浆样品处理取空白血浆样品300 μL放入2 mL离心管中，加乙腈700 μL，旋涡混合5 min，16 000 r/min离心15 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤后转移至自动进样器小瓶。

2.3方法专属性试验按照上述方法，INH、AcINH、RFP、PZA各组分有较好的分离，互不干扰，血浆中的杂质峰对样品的测定亦无影响。

2.4线性关系考察精密称取INH、AcINH、RFP、PZA对照品置于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解后稀释至刻度，配制成浓度均为1 000 μg/mL的标准储备液。取2 mL离心管，每只加入不同量含INH、AcINH、RFP、PZA的标准储备液及300 μL空白血浆，使血浆药物浓度为0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg/mL。参照2.2操作，记录色谱图，以浓度(C)为横坐标，样品峰面积比值(Y)为纵坐标作线性回归。结果显示各组分在0.15~38.4 μg/mL范围内线性良好，见表1。

表1　HPLC的回归方程和线性范围

2.5精密度(RSD)试验分别于300 μL的空白血浆中加入各标准储备液，精确配制成含低、中、高3种不同浓度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA血浆样品，按2.2操作，测定日内(连测5次，取均值)和日间(连测5天，取均值)RSD，结果显示RSD均小于10%。见表2。

表2　HPLC日间、日内RSD试验结果

2.6稳定性试验于300 μL空白血浆中加入各标准储备液，精确配制成含低、中、高3种不同浓度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA的血浆样品，分别室温放置0、2、4、8、12 h后按2.2操作，测定峰面积。结果显示测定结果在不同时间点基本保持稳定，见表3。

2.7回收率试验分别于300 μL空白血浆中加入各标准储备液，精确配制成含低、中、高浓度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA的血浆样品，按2.2操作，每个浓度测5遍，计算平均回收率和RSD。通过表4可知四种组分不同浓度回收率的RSD均小于10%。

表3　HPLC的稳定性试验结果

表4　HPLC的回收率试验结果(%)

3HPLC验证血药浓度

选择肺结核患者10例，男7例、女3例，年龄25~60岁。均采用标准初治方案(2HREZ/4HR方案)治疗。具体方法：INH 0.3 g，1次/天；RFP 0.45 g，1次/天；乙胺丁醇0.75 g，1次/天；PZA 0.5 g，2次/天。患者服药5天采集血样，采用上述建立的HPLC同时测定INH、AcINH、RFP、PZA的血药浓度。3 h内分析完毕。结果显示，INH血药浓度为0.40~5.90(1.80±0.54)μg/mL，AcINH为0.31~3.10(1.61±0.64)μg/mL，RFP为5.50~12.80(7.78±3.06)μg/mL，PZA为2.98~17.37 μg/mL(7.12±3.21 μg/mL)。除1例AcINH和1例RFP血药浓度低于线性范围外，其余数据均在线性范围内。

4讨论

INH、RFP、PZA、乙胺丁醇是结核病初始治疗中最重要的几种药物，由于乙胺丁醇分子中缺乏共轭结构，没有紫外吸收，因此不能被紫外检测到。本研究中HPLC使用的是紫外检测器，所以不能观察乙胺丁醇的血药浓度。由于INH、AcINH、RFP、PZA的极性相差较大，分析此类物质一般会使用敏感性较高的液相-质谱法联用(LC-MS)，鲜有采用HPLC分析血浆中这几种药物浓度的报道，且在为数不多的采用HPLC进行分析的几篇报道中均使用离子对试剂[11,12]。本课题组经过试验后认为离子对试剂存在柱平衡时间长、重现性差、对色谱柱损害大和成本高等缺点，不宜作为一种常规检测方法用于血药浓度检测。本课题组之前使用磷酸缓冲盐和甲醇建立了分析血浆INH、AcINH和PZA的方法[12～15]。由于RFP极性较小，我们首先在原有方法学中增加梯度洗脱的程序。在分析完INH、AcINH和PZA后逐步提高甲醇比例至90%。此方法虽然可以分析血药浓度，但存在以下不足：①甲醇洗脱能力相对较弱，导致RFP出峰时间过晚，整个分析时间超过45 min；②需调整甲醇比例至90%，如此高的有机相比例有可能引起缓冲盐析出，堵塞色谱系统；③由于洗脱梯度较陡，在后面的色谱图中出现了较为明显的溶剂峰，增加了分辨主峰的难度。将甲醇换为洗脱能力较强的乙腈后发现，虽然只需要65%的有机相就可以使RFP在十几分钟出峰，但是AcINH和INH的分离度降低，使得这两种组分无法分离。本研究通过增加色谱柱的长度，成功解决了上述组分无法分离的问题。使用250 mm的C18柱，在乙腈和磷酸盐的体系中可以很好地实现各组分的分离和分析。此外，为了避免溶剂峰影响RFP的分析，可以在340 nm波长对其进行检测。340 nm是RFP的特征吸收波长，对其他物质和溶剂几乎不会产生干扰。

本研究发现，采用2HREZ/4HR方案治疗的肺结核患者即使样本中各药物含量低，采用本研究所建立的HPLC在0.15~38.4 μg/mL的线性范围也能准确被测定，并且检测时间符合临床检测的需要。借助于血药浓度监测，可以发现个体差异导致血药浓度偏离正常值的情况，从而为实现结核病患者个体化治疗打下基础。本试验简单、准确、经济，敏感性并不不低于LC-MS，方法回收率高于80%，日间和日内RSD小于10%，符合生物样品分析要求。10例肺结核患者的INH、AcINH、RFP、PZA血药浓度检测结果显示，除1例AcINH和1例RFP血药浓度低于线性范围外，其余数据均在线性范围内。说明本研究建立的HPLC可用于临床药物检测及药物动力学研究。

总之，本研究成功建立了同时检测血浆INH、AcINH、RFP、PZA的HPLC，该法专属性好，样品处理简单，符合生物样品分析要求，可用于临床常规开展抗结核药的血药浓度检测。

参考文献：《山东医药》著录要求 每篇论文须标引10～20条。正文中引用的文献采用顺序编码制，以引用文献的先后顺序连续编码，并将序号置于方括号中。文后参考文献按GB/T7714-2005《文后参考文献著录规则》采用顺序编码制标注，序号置于方括号中，排列于文后。内部刊物、未发表资料、个人通信等请勿作为文献引用，确需引用时，可将其在正文相应处注明。引用文献(包括文字和表达的原意)务请作者与原文核对无误。日文汉字请按日文规定书写，勿与我国汉字及简化字混淆。参考文献中的作者前1～3名全部列出，3名以上只列前3名，后依文种加表示“，等”的文字。作者姓名一律姓氏在前，名字在后，外国人的名字采用首字母缩写姓氏，缩写名后不加缩写点；不同作者之间用“，”隔开。外文期刊名称用缩写，以Index Medicus中的格式为准；中文期刊用全名。论文题目后加文献类型及标识，如专著[M]、期刊文章[J]等。每条参考文献均须著录卷、期及起止页。作者必须自行核对参考文献原文，无误后将其按引用顺序(用阿拉伯数字)排列于文末。举例：

[1] 唐神结,肖和平.结核病流行趋势及治疗未来展望[J].中国实用内科杂志,2012,32(8):565-568.

[2] 张震冬,张海燕,林存智.WHO第四版结核病治疗指南解读[J].中华临床医师杂志,2014,12(8):4251-4253.

[3] 周忠海,杨国锋,付春生,等.耐药结核病研究进展[J].山东医药,2011,51(3):109-110.

[4] 王燕,景辉,王俊玲,等.临床结核病耐药性变化趋势的动态监测[J].山东医药,2011,51(49):38-40.

[5] 苗积生,潘惠忠,黄利群.异烟肼乙酰化代谢的遗传分型[J].临床肺科杂志,1997,2(1):28-30.

[6] 郎美琦,蒋利,黄佳盛.抗结核病药物治疗综述[J].临床肺科杂志,2010,15(8):1153-1154.

[7] Calleri E, Lorenzi DE, Furlanetto S, et al. Validation of a RP-LC method for the simultaneous determination of isoniazid, pyrazinamide and rifampicin in a pharmaceutical formulation[J]. Pharm Biomed Anal, 2002,29(6):1089-1096.

[8] Khuhawar MY, Rind FMA. Liquid chromatographic determination of isoniazid, pyrazinamide and rifampicin from pharmaceutical preparations and blood[J]. Chromatogr B, 2002,766(2):357-363.

[9] 戚燕,杨庆云,吴松.HPLC法测定乙胺吡嗪利福异烟片中4组分含量[J].中国药师,2008,11(12):1455-1458.

[10] 李群力,蒋晓萌,施存元.高效液相色谱法测定复方利福平片中利福平、异烟肼及吡嗪酰胺的含量[J].中国抗生素杂志,2002,27(9):570-571.

[11] Gong Z, Basir Y, Chu D, et al. A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of anti-tuberculosis drugs-ethambutol and pyrazinamide in human plasma[J]. Chromatogr B, 2009,877(16):1698-1703.

[12] Zhou ZF, Chen LY, Liu P, et al. Stimulatneous deteination of isoniazid, pyrazinamide, rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high-perfomance liquid chromatography[J]. Anal Sci, 2010,26(11):1133-1138.

[13] 张亮,钱智磊,陆磊,等.高效液相色谱法同时测定人血浆中异烟肼、乙酰异烟肼和吡嗪酰胺的浓度[J].药学与临床研究,2014,22(2):112-114.

[14] 钱智磊,张亮,周秋云,等.HPLC法测定结核病患者血浆中异烟肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的质量浓度[J].西北药学杂志,2014,29(6):578-581.

[15] 张亮,侯文洁,钱智磊,等.RP-HPLC法测定患者血浆中异烟肼及乙酰异烟肼的浓度[J].实用药物与临床,2014,17(12):1586-1588.

·作者·编者·读者·

[1] 杜贾军,孟龙,陈景寒,等.手辅助电视胸腔镜食管切除胃食管胸内吻合术[J].山东医药,2004,44(27):1-3.

[2] Takano M, Mizuno K, Okamatsu K, et al. Mechanical and structural characteristics of vulnerable plaques: analysis by coronary angioscopy and intravascular ultrasound[J]. J Am Coll Cardiol, 2002,38(1):99-104.

[3] 叶任高,陆再英.内科学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2000:277-280.

Establishment and application of HPLC in determining INH, AcINH, RFP

and PZA simultaneously in plasma of patients with tuberculosis

ZHANGLiang,QIANZhi-lei,LULei,HOUWen-jie,DINGHong-zi,WANGJie

(NanjingChestHospital,Nanjing210029,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the high-performance liquid chromatography (HPLC) in order to determine the concentration of isoniazid (INH), rifampicin (RFP), pyrazinamide (PZA) and acetylisoniazid (AcINH) simultaneously in the plasma of patients with tuberculosis, and to verify its effect. MethodsThe HPLC method was carried out on a Waters Xselect-HSS T3 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column with 0.05 mol/L KH2PO4(adjusting PH to 5.6 with triethylamine)-acetonitrile as mobile phase. The column temperature was 40 ℃, the flow rate was 0.8-1.0 mL/min, and the inject volume was 20 μL. Meanwhile, the plasma containing reference substances of INH, RFP, PZA and AcINH were injected. Then we tested the specificity, linear relationship, precision, accuracy, stabilization and extraction recovery. We detected the concentrations of INH, AcINH, RFP and PZA in the plasma of 10 tuberculosis patients who took INH, RFP and PZA as treatment program by HPLC method. ResultsThis method had a good separation effect on INH, AcINH, RFP, and PZA without interference of each other, and all calibration curves had good linearity (r2>0.99) within the test ranges. The intra- and inter-day precision was less than 10%, the extraction recovery was between 80%-120%. Except 1 case of AcINH and 1 case of RFP below the linear range, during the 10 tuberculosis patients, the rest were within the linear range. ConclusionsHPLC that can determine the concentrations of INH, PZA, RFP and AcINH simultaneously in plasma of tuberculosis patients is successfully established. The method is sensitive, simple and rapid. It is suitable for analytical require of biological samples.

Key words:tuberculosis; high-performance liquid chromatography (HPLC); isoniazid; rifampicin; pyrazinamide; acetylisoniazid; blood drug concentration

收稿日期：(2014-05-08)

中图分类号：R52

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)48-0023-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.007

通信作者简介：王洁(1965-)，女，主任药师，研究方向为临床药学。E-mail: 13905165431@163.com

作者简介：第一张亮(1984-)，男，药师，研究方向为体内药物分析及个体化给药。E-mail: zhshine310@163.com

基金项目：南京市医学科技发展重点项目(zkx13041)。