氯吡格雷对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶含量及CYP3A4活性的影响

杨光远韩梅王明富陈锋孔繁和张磊艺赵晓辉刘明远

(佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探讨氯吡格雷对大鼠肝微粒体细胞色素P450 (CYP450) 含量及CYP3A4活性的影响。方法以生理盐水为对照，对照组大鼠灌胃给予1 ml生理盐水，氯吡格雷组大鼠每日灌胃给予6.75 mg/kg的氯吡格雷，连续7 d，然后测定大鼠肝微体中CYP450含量及CYP3A4活性。结果与对照组比较，氯吡格雷组的肝微粒体CYP450含量无变化( P>0.05)，CYP3A4活性明显降低 (P<0.01)。结论氯吡格雷对CYP450含量无影响，但对CYP3A4活性有抑制作用。

关键词〔〕氯吡格雷;CYP450; CYP3A4

中图分类号〔〕R969.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省教育厅面上项目资助(No.12511571)

通讯作者：刘明远(1973-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事药物分析及药物代谢研究。

第一作者：杨光远(1975-)，男，副教授，主要从事心血管药理及药物相互作用研究。

氯吡格雷是一类具有抗血小板作用的噻吩并吡啶衍生物，需要经肝细胞色素P450酶生物转化为有活性的代谢物方能起作用。催化激活氯吡格雷的肝细胞色素P450酶主要为CYP3A4，其他肝细胞色素P450酶如：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9及CYP2C19也参与氯吡格雷的代谢过程〔1〕。药物对肝微粒体CYP450酶的作用是药物间发生相互作用的重要机制之一，氯吡格雷与多种药物联用发生代谢性相互作用的报道屡见不鲜，如质子泵抑制剂〔2〕、降脂药〔3〕、钙通道阻滞药〔4〕及选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)类抗抑郁药等〔5〕。关于氯吡格雷口服给药对肝微粒体酶的影响，目前尚未见文献报道。本试验旨在探讨氯吡格雷对大鼠肝细胞色素P450酶含量及肝微粒体中最重要的亚型CYP3A4活性的影响，以考察其是否会在临床联合用药时存在潜在的代谢性相互作用。

1材料与方法

1.1试验动物体重200～250 g的Wistar雄性大鼠，佳木斯大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK-(黑)2013-001)。

1.2试剂与仪器硫酸氢氯吡格雷对照品(中国食品药品检定研究院)；咪达唑仑(含量>98%，徐州恩华药业集团有限责任公司)；1′-羟基咪达唑仑(含量>98%，Sigma公司)； Agilent 1100高效液相色谱系统(Agilent公司，美国)；QTRAP型三重四极杆串联质谱仪(Applied Biosystem公司，美国)。

1.3方法

1.3.1大鼠给药方案健康Wistar大鼠18只，雄性，随机分成三组，每组6只，各组等体积连续7 d给予生理盐水或相应药物。对照组灌胃给予生理盐水；氯吡格雷组，灌胃给予氯吡格雷6.75 mg/kg；苯巴比妥组每日按75 mg/kg剂量腹腔注射苯巴比妥。

1.3.2大鼠肝微粒体的制备上述各组大鼠末次给药后，第2日拉颈椎处死动物，打开腹腔，取出肝脏，立即放入0.25 mol/L冰冷的蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，冰上用剪刀将肝脏剪碎，洗至无血色；取2 g已剪碎的肝脏，加入1 ml蔗糖溶液，用组织匀浆机于冰浴中制成匀浆；4℃下，先将样品 20 000 r/min离心20 min后，再取上清液，于100 000 r/min离心60 min，弃去上清液，用0.1 mmol/L Tris盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH7.4)将沉淀悬浮均匀，-80℃保存。

1.3.3肝微粒体蛋白浓度测定〔6〕以牛血清白蛋白为标准，用NaOH稀释肝微粒体样品，依照标准曲线计算肝微粒体中蛋白浓度。

1.3.4肝微粒体CYP450含量测定〔7〕分别记录450 nm和490 nm下各样品的吸收度，根据下式计算CYP450的含量，CYP450(nmol/mg protein)=〔A(450 nm-490 nm)1000〕/(91C)。

1.3.5肝微粒体CYP3A4亚型活性测定依据文献选取咪达唑仑作为CYP3A4的特异性底物〔8〕，每个样品建立500 μl孵育体系。孵育体系中各成分及其终浓度、反应终止过程见文献〔9〕。经样品处理后，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定咪达唑仑的代谢产物1′-羟基咪达唑仑的浓度，并计算出该代谢产物的生成速度。

1.4统计学方法应用SPSS10.0软件进行t检验。

2结果

2.1各组大鼠肝微粒体中CYP450含量氯吡格雷给药组CYP450 含量〔(0.74±0.22)nmol/mg prot〕略高于对照组〔(0.72±0.24)nmol/mg prot〕，但二者之间无统计学差异(P>0.05);与对照组比较，苯巴比妥钠给药组CYP450含量〔(1.64±0.33)nmol/mg prot〕明显增加(P<0.01)。

2.2各组大鼠肝微粒体CYP3A4活性对照组大鼠肝微粒体CYP 3A4的活性为(0.059 ± 0.012)nmol·mg-1·min-1，氯吡格雷给药组大鼠肝微粒体CYP 3A4的活性为(0.042±0.007)nmol·mg-1·min-1，氯吡格雷给药组明显低于对照组(P<0.05)。

3讨论

心血管药物应用的长期性增加了其与其他药物联合应用的机会，发生药物间相互作用的可能性也随之增加。氯吡格雷是临床常用的抗血小板聚集药物，研究表明，氯吡格雷可明显降低经皮冠状动脉介入术(PCI) 和急性冠脉综合征(ACS)后各种缺血事件的发生率〔10〕。氯吡格雷与其他药物联用在老年人中非常常见。药物联用时，在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段均可发生药物间相互作用，其中发生率最高的是代谢性相互作用。CYP450酶系是重要的药物代谢酶，造成代谢性药物相互作用的主要原因是CYP450酶系。而CYP3A4是CYP450中最重要的亚族，可参与约50%的药物代谢〔11〕。对CYP3A4 活性有明显影响的药物，如与CYP3A4底物联用，很可能会引起极其严重的药物相互作用。

本试验结果提示，氯吡格雷可能会改变合并用药时经CYP3A4代谢药物的代谢速率，为避免发生不良反应，应注意减少后者的用量。大鼠和人之间在药物对肝微粒体酶的作用方面存在一定的种属差异〔12〕，因此，氯吡格雷在临床上是否会出现抑制CYP3A4活性的作用，还需进一步研究。

4参考文献

1Ma TK，Lam YY，Tan VP，etal.Impact of genetic and acquired alteration in cytochrome P450 system on pharmacologic and clinical response to clopidogrel〔J〕.Pharmacol Ther，2010;125(2):249-59.

2Kwok CS，Loke YK.Meta-analysis: the effects of proton pump inhibitors on cardiovascular events and mortality in patients receiving clopidogrel〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2010;31(8):810-23.

3Kostapanos MS，Milionis HJ，Elisaf MS.Rosuvastatin-associated adverse effects and drug-drug interactions in the clinical setting of dyslipidemia〔J〕.Am J Cardiovasc Drugs，2010;10(1):11-28.

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7Omura T，Sato R.The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes.Ⅰ.Evidence for its hemoprotein nature〔J〕.J Biol Chem，1964;239(7):2370-8.

8Qin CZ，Ren X，Tan ZR，etal.A high-throughput inhibition screening of major human cytochrome P450 enzymes using an in vitro cocktail and liquid chromatography-tandem mass spectrometry〔J〕.Biomed Chromatogr，2014;28(2):197-203.

9刘明远，杨光远，王跃新，等.褪黑素对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(11)：2018-9.

10Yusuf S，Zhao F，Mehta SR，etal.Effects of clopidogrel in addition to aspirin in patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation〔J〕.N Engl J Med，2001;345(7):494-502.

11Smith DA，Jones BC.Speculations on the substrate structure-activity relationship ( SSAR) of cytochrome P450 enzymes〔J〕.Biochem Pharmacol，1992;44(11):2089-98.

12Graham MJ，Lake BG.Induction of drug metabolism: species differences and toxicological relevance〔J〕.Toxicology，2008;254(3):184-91.

〔2015-03-11修回〕

(编辑袁左鸣)