孙晓勉，陆 洋，黄旭丽

(1.深圳市福田区妇幼保健院儿保科，广东 深圳 518000：2.南华大学研究生院，湖南 衡阳 421000)

深圳市福田区新生儿听力及耳聋基因联合筛查分析

孙晓勉1，陆 洋2，黄旭丽1

(1.深圳市福田区妇幼保健院儿保科，广东 深圳 518000：2.南华大学研究生院，湖南 衡阳 421000)

目的 采用物理测听和飞行时间质谱检测技术对福田区所属4家医院产科出生的所有新生儿进行听力及耳聋基因联合筛查，阶段性分析在深圳市新生儿中普遍进行听力和耳聋基因联合检测的临床应用价值。方法 在深圳市福田辖区4家医院产科中，经新生儿监护人的知情同意，采集2014年7月至12月出生的新生儿足底血4 972份，提取全基因组DNA，用飞行时间质谱检测技术检测中国人群中常见的4个耳聋相关基因的20个突变位点，包括GJB2基因(35delG、167delT、176-191dell6、235delC、299-300delAT)，GJB3(538CA>T、547G>A)，SLC26A4(281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVSl5+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G)，线粒体12SrRNA(1494C>T、1555A>G)。同时进行听力筛查，听力初筛采用耳声发射(OAE)，复筛用OAE结合听性脑干反应(ABR)。结果 4 972例中听力初筛未通过199例，占总数的4%，复筛时未通过13例，占0.3%；4 972例新生儿检测出GJB2基因c.235delC、c.176del16和c.299-300delAT，35delG四种突变共90例；SLC26A4基因1174A>T、1226G>A、2168A>G、IVS7-2A>G突变74例；GJB3基因突变17例；线粒体12SrRNA基因m.1555A>G突变16例，线粒体12SrRNA基因m.1494C>T突变1例。GJB2基因299-300delAT、SCL26A4基因IVS7-2AG复合杂合突变，GJB2基因235del、12SrRNA1555AG复合杂合突变、GJB3基因538CT、SLC26A4基因IVS7-2AG复合杂合突变分别各1例。结论 福田区没有耳聋家族史的新生儿中，GJB2基因的杂合突变率高于SLC26A4基因突变率，GJB3基因和线粒体12SrRNA基因突变较为少见，遗传性耳聋基因检测技术在新生儿筛查中具有很重要的临床应用价值，对新生聋儿的早期发现和早期治疗具有较重要的作用。

新生儿；听力筛查；耳聋基因；联合筛查

聋病是人类最常见的感觉功能障碍，是影响人类健康和造成人类残疾的常见原因，也是临床常见的遗传病之一[1]。2006年中国第2次残疾人抽样调查显示，现有听力残疾者达2 780万人，位居各类残疾性疾病之首(占28%)，其中7岁以下的聋儿达80万人，并以每年新增3万聋儿的速度在增长。据统计，每1 000名新生儿中，就有1～3例听力障碍儿童，其中至少一半与遗传因素有关[2]。

遗传性耳聋分为非综合征型和综合征型两种类型，我国人群的大规模耳聋分子流行病学研究表明，大部分的非综合征型耳聋由几个基因的突变引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)和线粒体DNA 12SrRNA基因[3]。

本研究采用快速、高通量的飞行时间质谱检测技术对4 972例新生儿进行4个耳聋相关基因的20个常见的突变位点筛查，以实现对聋儿的早期发现和早期治疗，降低新生儿聋病的发生率。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年7月至12月在福田区4家医院产科出生，Apgar评分8～10分，无产科合并症，母婴同室的全部符合条件的新生儿4 972例为研究对象。孕周37～40周，体重2 350～3 760g，孕母妊娠期有特殊用药及听力损害家族史除外。其中男2 913例，女2 059例，男女比例1.41:1，均为汉族。

1.2 方法

1.2.1 听力筛查方法

听力初筛采用畸变产物耳声发射(OAE)，复筛采用OAE结合听性脑干诱发电位(ABR)。初筛时间为出生后3～5天，复筛为出生后42天，复筛未通过的患儿于生后3个月时行听力学评估和诊断。

1.2.2 听力诊断方法

根据患儿具体情况，采用听性脑干反应、听性稳态反应、声导抗等，部分行颞骨CT扫描或核磁共振检查。

1.2.3 聋病易感基因筛查方法

1.2.3.1 标本采集 经新生儿监护人书面知情同意后，由经过培训的护理人员采集新生儿足跟血，置于采血滤纸片上，晾干后0～8℃保存备用。

1.2.3.2 基因检测 抽提基因组DNA的血样，送到华大基因实验室，利用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，简称MALDI-TOFMS)技术对耳聋基因进行检测[4]。MALDI-TOFMS技术的主要特点是，将制备的样本分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10～9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。即行耳聋易感基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、线粒体12SrRNA基因的20个位点检测。

1.3 随访

对于听力筛查和基因筛查结果异常者定期对其听力情况、语言发育情况、干预情况等进行随访并给预防聋指导。

2 结果

2.1 听力筛查结果

4 972例新生儿中，初筛耳声发射检测通过4 773例，未通过199例，初筛未通过率4.06%，3 025例同时接受了听性脑干复测，未通过13例。

2.2 聋病易感基因的检测结果

4 972例新生儿中进行了聋病易感基因的筛查，结果异常的有201例，总体阳性率为4.05%，各基因组检出率进行卡方检验，χ2=1.525，P=0.000<0.001,差异有统计学意义，说明4个基因的检出率之间有差别。异常基因分布情况见表1。其中199例听力初筛未通过的新生儿中，聋病易感基因的筛查结果异常的有99例，耳聋基因总阳性率为49.7%(99/199)、致病突变率10.1%(20/199)、杂合携带率61.3%(122/199)，4 773例听力初筛通过新生儿中聋病易感基因的筛查，结果异常的有102例，耳聋基因总阳性率2.13%(102/4 773)，致病突变率0.29%(14/4 773)，杂合携带率1.66%(79/4 773)。

从4个基因各位点的比较得出本人群的突变形式有GJB2基因有235delCA、299-300delAT、176-191del16、35delG突变，SLC26A4位点有IVS7-2AG、1174AT、2168ACT、1226GT突变，12SrRNA的位点有1494CT纯合突变、1555AG纯合突变，GJB3基因有538CT和547GA位点杂合突变。总致病突变携带率为4.05%，从高到低的排位是GJB2235delCA(1.37%)、SLC26A4IVS7-2AG(0.95%)、12SrRNA1555AG(0.32%)、GJB3538CT(0.18%)、547GA(0.16%)。

(转下表)

(续上表)

2.3 聋病易感基因突变与性别的关系

2 913例男性新生儿中出现耳聋易感基因突变123例，突变携带率4.22%，2 059例女性新生儿中出现耳聋易感基因突变78例，突变携带率为3.79%，比较男女两组间聋病易感基因突变携带率，差异无统计学意义(χ2=0.586，P=0.444>0.05)。

2.4 聋病基因突变与孕母年龄的关系

将孕母按照妊娠年龄分为20～<25岁；25～<30岁；30～<35岁；35～<40岁；40岁及以上4组，比较各组间新生婴儿聋病易感基因突变携带率差异，结果显示无统计学意义(χ2=4.252，P=0.373>0.05)，见表2。

表2 不同妊娠年龄孕母所生新生儿聋病易感基因突变携带率比较

Tabel 2 Comparison of susceptibility gene mutation carrier rate of deaf disease among newborns of women with different maternal gestational age

3 讨论

3.1 新生儿听力及耳聋基因联合筛查的临床意义

耳聋是临床上最常见的遗传病之一，有60%的耳聋是由遗传缺陷引起的[5]，而且在大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由于自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病[6]。目前，我国各省市正在普及采用物理方法来进行新生儿听力筛查，但随着听力筛查的逐渐普及，临床也开始发现这一物理筛查方法的不足，如对迟发性耳聋和药物性耳聋的漏检，对先天性耳聋的确诊需要经过多次随访，到2岁前后才能给出确切的结论，不能及早采取干预措施，错过了孩子语言培训的最佳时机，甚至导致由聋致哑。

王秋菊等于2007年提出，在新生儿听力筛查中注入基因筛查的理念，实施新生儿的听力及基因的同步筛查是目前作为早期发现处于语前听力损失或迟发型高危患儿或者是致聋基因的携带者最为有力的筛查策略。

本次检测耳聋基因总阳性率为4.05%，听力初筛未通过新生儿耳聋基因总阳性率、致病突变率、杂合携带率均明显高于听力初筛通过新生儿，提示可将听力初筛未通过新生儿作为目标人群进行常见耳聋基因筛查。但在本研究中，通过听力筛查的新生儿中检测到了致病突变201例，特别是有17例是药物性耳聋相关基因和17例可能导致迟发性的，通过基因检测，进行早期预警可避免药物性耳聋发生，对迟发性听力损失可进行早期干预。

3.2 异常耳聋基因携带者基因类型分布

我国聋病分子流行病学调查(2007年)显示，21%的耳聋患者带有GJB2基因突变，14.5%的患者带有SLC26A4基因突变，3.8%和0.6%的患者分别带有mtDNAA1555G和C1494T突变。

GJB2是引起非综合性遗传性耳聋最常见的聋病基因[7]，突变类型中主要235delC、299-300delAT、176-191del16[8]。本研究检测结果中GJB2基因5个位点异常共有90例，占1.81%，携带率最高，突变也集中在235delC、299-300delAT、176-191del16这3个位点，还检测到1例35delG突变，未检测到167delT突变，检测结果与文献报道的相似。因GJB2基因相关耳聋患者的螺旋神经节细胞数量正常，适合人工耳蜗植入，该类患者在人工耳蜗植入后语言理解能力强，故明确GJB2基因突变致聋对治疗和预后有重要意义。

Dai等(2009年)研究认为SLC26A4基因是仅次于GJB2突变而引起感音神经性聋的遗传学病因，本研究中SLC26A4基因突变阳性率为1.49%，在4个基因中突变阳性率位于第2位，与文献报道一致[9]。SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征有密切关系[10]，凡是引起颅内压变化的因素如轻度的头部碰撞、重度感冒等均能引起大前庭水管综合征患儿的听力下降及时检测出SLC26A4基因突变可以指导患者在日常生活中避免激烈运动，颅脑外伤等环境因素导致迟发性的进行性听力下降。及时发现病因，提示加强日常防护对避免或延缓患儿听力损失甚为重要。

线粒体DNA 12SrRNA是最为常见的后天性氨基糖苷类药物所致的药物中毒性耳聋的原因之一[11]。A1555G突变在氨基糖苷类抗生素使用史听力障碍患者中的发病率较高，氨基糖苷类抗生素使用史听力障碍患者中可以发现13%～33%的患者有A1555G突变，本研究17名通过听力筛查的新生儿中检测到线粒体DNA 12SrRNA1555AG纯合突变16例，1例DNA 12SrRNA1494CT纯合突变，均为致病突变，虽全部通过了听力筛查，但如果以后使用氨基糖苷类抗生素，可出现“一针致聋”的后果。告知家长检测结果，提示对这17名婴儿应高度预警，避免使用此类耳毒性药物，基因检测让这些患儿终生受益。同时，由于线粒体DNA为母系遗传，此基因检测结果对家系中所有母系成员均可起到预警的作用。

GJB3基因是我国本土克隆和鉴定的第1个耳聋致病基因，可引起常染色体显性或隐性遗传性非综合征性耳聋，被认为与高频听力下降有关[12]。本研究共检出17例GJB3杂合突变，该17例婴儿42d时经DPOAE和ABR筛查均显示通过，对这些婴儿应定期进行听力学监测，以早期发现听力损失早期干预。

3.3 聋病易感基因与性别及母亲生育年龄无关

本研究比较聋病易感基因携带的男女性别差异及孕母不同年龄生产的新生儿聋病易感基因携带状况，均未显示明显差异，与有资料显示聋病易感基因携带存在男性多于女性的差异不同。说明不同性别、区域及各个年龄段母亲所生新生儿均有进行聋病易感基因筛查的必要性。

综上所述，在现行听力筛查基础上联合开展聋病易感基因普遍筛查，采用飞行时间质谱检测技术对常见耳聋相关基因热点突变检出率较高、结果准确，具有快速、高通量、操作简单等特点，能够满足临床耳聋基因检测的要求，应用于新生儿筛查，能够有效检出携带者及耳聋患儿，对遗传性聋高危儿童及时进行听力学监控和随访，对药物中毒性耳聋高危儿童进行终生用药指导、生活行为指导，进行人工耳蜗植入手术疗效预测、遗传咨询和生育指导，对完善防聋治聋策略，降低遗传性聋的发病率，致残率意义重大。

[1]Mahboubi H, Dwabe S, Fradkin M,etal. Genetics of hearing loss where are we standing now[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol,2012,269(7):1733-1745.

[2]陈军,邓虹,潘贵霞.安庆市新生儿听力筛查5 315例结果分析[J].中国妇幼健康研究,2014,25(1):64-65.

[3]Papacharalampous G X, Nikolopoulos T P, Davilis D I,etal.Universal newborn hearing screening, a revolutionary diagnosis of deafness:real benefits and limitations[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2011,268(10):1399-1406.

[4]Wilcken B.Screening for disease in the newborn: the evidence base for blood-spot screening[J]. Pathology,2012,44(2):73-79.

[5]邵平,李卫芹.天津新生儿听力筛查与救助项目成本效益分析[J].中国妇幼健康研究,2013,24(2):228-230.

[6]刘亚锋,刘小红,李冰琳.窒息新生儿听力筛查结果分析[J].中国妇幼健康研究,2012,23(4):514-516.

[7]胡书君,张鹏,郑锦,等.洛阳地区648例高危新生儿听力障碍筛查结果分析[J].中国妇幼健康研究,2010,21(2):217-219.

[8]纪育斌,兰兰,王大勇,等.中国非综合征型聋患者GJB2基因突变流行病学文献荟萃分析[J].听力学及言语疾病杂志,2011,19(4):323-327.

[9]Fang Y, Gu M, Wang C,etal.GJB2 as Well as SLC26A4 Gene Mutations are Prominent Causes for Congenital Deafness[J].Cell Biochem Biophys,2015,[Epub ahead of print].

[10]Song M H, Shin J W, Park H J,etal.Intrafamilial phenotypic variability in families with biallelic SLC26A4 mutations[J].Laryngoscope,2014,124(5):E194-E202.

[11]Olusanya B O, Akinyemi O O. Community-based infant hearing screening in a developing country:parental up take of follow-up serviees[J].BMC Publie Health,2009,9:66

[12]李红娟,宋亚亮,刘黎明,等.语前聋患儿基因突变诊断的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2008,19(6):587-588.

[专业责任编辑：刘黎明]

Hearing screening combined with deafness gene screening in newborns in Futian District

SUN Xiao-mian1, LU Yang2, HUANG Xu-li1

(1.DepartmentofChildHealth,ShenzhenMaternalandChildHealthCareHospital,GuangdongShenzhen518000,China; 2.UniversityofSouthChina,HunanHengyang421000,China)

Objective To perform hearing and deafness genes combined screening for all newborns born in four maternity hospitals in Futian District by using time of flight mass spectrometry (TOF-MS) detection and physical audiometry technology and to conduct periodic analysis of clinical applications of hearing and deafness genes combined detection in newborns in Shenzhen. Methods In four maternity hospitals in Futian District, 4 972 planta blood samples of newborns were collected during July to December in 2014 with guardian consent, and whole genomic DNA was extracted. TOF-MS was used to detect 20 mutation sites in four common deafness genes of Chinese population, including GJB2 gene (35delG, 167delT, 176-191dell6, 235delC, 299-300 delAT), GJB3 (538CA>T, 547G>A), SLC26A4 (281C T, 589G>A, IVS7-2A>G, 1174A >T, 1226G>A, 1229C>T, IVSl5+5G>A, 1975G>C, 2027T>A, 2162C>T, 2168A>G), mitochondria 12SrRNA (1494C>T, 1555A>G). At the same time hearing screening was performed with otoacoustic emission (OAE) and combining OAE with auditory brainstem response (ABR) for secondary screening. Results Of 4 972 patients 199 cases (4%) did not pass hearing screening and 13 cases (0.3%) did not pass secondary screening. Ninety cases were found with GJB2 gene c.235delC, c.176del16, c.299-300delAT and 35delG mutation, 74 cases were found with SLC26A4 gene 1174A>T, 1226G>A, 2168A>G, IVS7-2A>G mutation, 17 cases with GJB3 mutation, 16 cases with mitochondrial gene 12SrRNA m.1555A>G mutation, and one case with mitochondrial gene 12SrRNA m.1494C>T mutation. GJB2 gene 299-300delAT, SCL26A4 IVS7-2AG compound heterozygous mutation, GJB2 gene 235del, 12SrRNA1555AG compound heterozygous mutation, GJB3 gene 538CT, and SLC26A4 gene IVS7-2AG compound heterozygous mutation were found in 1 case, respectively. Conclusion Of the newborns without family history of deafness in Futian District, heterozygous mutation rate of GJB2 gene is higher than mutation rate of SLC26A4 gene, and gene mutations of GJB3 gene and 12SrRNA mitochondrial gene are rare. Genetic testing technology for hereditary deafness in newborn screening is very important in clinics, which is essential to early detection and early treatment of newborn deafness.

newborns; hearing screening; deafness gene; combined screening

2015-05-22

深圳市科创委知识创新计划资助项目(项目编号：JCYJ20140415094713859)

孙晓勉(1961-)，女，主任医师，主要从事儿童保健工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.004

R764.04

A

1673-5293(2015)06-1119-1121