马贯立，蔡章成，胡伟杰，董 研

(1.杭州市萧山区中医骨伤科医院口腔科，浙江 杭州 311200；2.温州市龙湾区第一人民医院口腔科，浙江 温州 325000；3.台州市天台县人民医院口腔科，浙江 台州 317200；4.浙江大学医学院附属第二医院口腔矫形科，浙江 杭州 310009)

乳牙根尖周炎中HCMV和EBV诱导细胞因子表达的研究

马贯立1，蔡章成2，胡伟杰3，董 研4

(1.杭州市萧山区中医骨伤科医院口腔科，浙江 杭州 311200；2.温州市龙湾区第一人民医院口腔科，浙江 温州 325000；3.台州市天台县人民医院口腔科，浙江 台州 317200；4.浙江大学医学院附属第二医院口腔矫形科，浙江 杭州 310009)

目的 研究人类巨细胞病毒(HCMV)和Epstein-Barr病毒(EBV)及其诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(γ-IFN)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-12在儿童乳牙根尖周炎中的表达情况。方法 收集15例有严重根尖病变的乳牙，取其根尖周肉芽组织作为实验组；同时收集15例无病变的乳牙，取其正常牙髓组织作为对照组。设计并合成引物，通过聚合酶链反应(PCR)检测HCMV、EBV及细胞因子的表达。结果 HCMV(χ2=17.368，P<0.05)和EBV(χ2=15.000，P<0.05)的表达在实验组和对照组之间具有显著性差异；细胞因子包括TNF-α(U=15.372，P<0.05)、γ-IFN(U=16.014，P<0.05)、IL-1β(U=13.833，P<0.05)、IL-6(U=10.416，P<0.05)、IL-10(U=12.105，P<0.05)和IL-12(U=11.961，P<0.05)的表达在两组之间也存在着显著性差异；在根尖周肉芽组织样本中，疱疹病毒(HCMV、EBV)与TNF-α、γ-IFN、IL-1β和IL-12的表达均呈显著正相关(r值为0.289～0.664，均P<0.05)。结论 HCMV和EBV及其诱导的组织破坏性细胞因子的释放可能在儿童乳牙根尖周炎的发病机理中起重要作用。

人类巨细胞病毒；Epstein-Barr病毒；细胞因子；聚合酶链反应；根尖周炎

乳牙根尖周病是一种感染性的炎症疾病，具有多种影像学临床表现。根尖周病损的不同临床征兆和/或临床症状及其病理分型是否与微生物或宿主对感染性病原体的免疫反应有关，还有待研究。已有研究发现，根尖周肉芽肿与疱疹病毒的感染有关，这些研究表明人类巨细胞病毒(HCMV)和Epstein-Barr病毒(EBV)与有症状的根尖周病变呈明显相关[1-4]。HCMV和EBV的活动性感染会激活巨噬细胞，生成大量的细胞因子和趋化因子，这些因子又会进一步诱导细胞活化和细胞因子生成，从而诱发一系列病理生理学变化。研究表明，细胞因子与根尖周炎的发生、发展和治疗相关[5-7]。因此，本研究通过检测HCMV和EBV及其诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(γ-IFN)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-12在儿童乳牙根尖周炎中的表达，为HCMV和EBV及其诱导的细胞因子参与儿童乳牙根尖周炎的发病机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

收集2014年9月至2015年3月就诊于杭州市萧山区中医骨伤科医院口腔科门诊的因严重根尖周病变而拔除的乳牙及因恒牙异位萌出而拔除的滞留乳牙各15颗，以前者的根尖周肉芽组织作为实验组，后者的乳牙牙髓组织作为对照组[8]。实验组年龄在4～8岁，平均年龄6.1±1.7岁；男孩6名，女孩9名。对照组年龄在7～10岁，平均年龄6.5±1.5岁；男孩8名，女孩7名。纳入标准：与乳牙根尖周炎诊断标准一致，患牙伴有叩痛、慢性窦道，X线片呈现根尖周阴影，但无牙根吸收，无明显根分歧吸收。排除标准：①患牙有侧穿、底穿、根折、根纵裂等明显结构异常者；②急慢性感染者；③伴有严重心肺肾功能异常或其他全身性免疫疾病者；④近2周内接受抗病毒药物治疗者等。

1.2 样本取材

局部麻醉前，患者用0.12%洗必泰漱口30s，并用其冲洗取样部位的牙齿、牙龈及口腔粘膜，用消毒好的无菌牙钳拔除患牙。实验组乳牙立即用无菌刀片及剪刀分离根尖部粘连的肉芽组织，对照组乳牙经牙体再次冲洗后，用锋利的无菌车针开髓，用蒸馏水冲洗髓腔，然后使用消毒过的拔髓针取出牙髓。将两组样本做好标记，置于无菌EP管中，立即冻存[8〗。

1.3 样本处理

用低转速设备进行组织样本匀浆，之后把样本分成两份，一份用于病毒DNA提取，另一份用于总RNA提取。提取出的DNA或RNA悬于100μL蒸馏水中，分别取出5μL用于PCR分析。

1.4 引物及DNA扩增

用Oligoware 1.0软件进行引物设计和分析，引物由上海生工合成。用50μL体系进行疱疹病毒PCR检测，其中包括30pmol上下游引物(上海生工)，2μL Taq DNA聚合酶、1.5mmol/L MgCl2、0.1mmol/L dNTP混合物、5μL 10×反应缓冲液(均购自大连TAKARA公司)和5μL DNA样本。PCR程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃末次延伸10min，33个循环。用感染和未感染的人外周血白细胞作为HCMV和EBV的阳性和阴性对照。

1.5 RNA提取及逆转录

参照EZ-RNA总RNA分离试剂盒(BioInd，Kibbutz Beit-Haemek，Israel)使用说明书从匀浆组织样本中提取总RNA，用于检测细胞因子基因转录物。用50μL RT混合物进行RT-PCR反应，其中包括10IU RT(Fermentas)，0.15mmol/L dNTP混合物，10μL 5×反应缓冲液(Fermentas)。42℃孵育之后，PCR程序同上。每个PCR分析均设置空白对照(蒸馏水)和阳性对照(质粒)，并用管家基因GAPDH作为内参。

1.6 结果检测

PCR扩增产物在含有0.5μg/mL溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。条带强度在凝胶成像分析系统(BioRad Laboratories，Hercules，CA)软件上进行比较。

1.7 统计学方法

用SPSS 13.0统计分析软件进行，计数资料用率或者百分比表示，采用卡方检验；两组之间PCR检测结果比较，采用Mann-WhitneyU检验；HCMV和EBV与细胞因子表达相关性，采用Spearman秩相关检验。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 两组人类巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒表达情况

从结果可以看出，HCMV和EBV在所有对照组的样本中都没有阳性表达，而两者在实验组样本中却有较高的阳性表达率。对于HCMV来说，有11例实验组样本检测呈阳性，检出率为73.3%，与对照组相比，χ2=17.368，P<0.05，差异具有显著性意义；对于EBV来说，有10例实验组样本检测呈阳性，检出率为66.7%，与对照组相比，χ2=15.000，P<0.05，差异具有显著性意义。见表1、表2和图1。

图1 HCMV和EBV在两组中的电泳结果

Fig.1 Electrophoretogram of HCMV and EBV in two groups

2.2 两组细胞因子的表达情况

从结果可以看出，TNF-α、γ-IFN、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12在对照组的所有样本中都没有阳性表达，而在除了编号5和12的两例实验组样本外，这些细胞因子在实验组样本中都有很高的阳性表达。与对照组相比，TNF-α(U=15.372，P<0.05)、γ-IFN(U=16.014，P<0.05)、IL-1β(U=13.833，P<0.05)、IL-6(U=10.416，P<0.05)、IL-10(U=12.105，P<0.05)和IL-12(U=11.961，P<0.05)在实验组中的表达均呈现出显著性差异。除此之外，在HCMV和EBV阳性表达的实验组样本中，TNF-α、γ-IFN、IL-1β和IL-12也相应地阳性高表达，这表明HCMV和EBV与这些细胞因子的表达均有明显的正相关。见表3和表4。

注：nd表示未检出。

表4 HCMV和EBV与细胞因子之间的相关性

Table 4 Correlation between HCMV and EBV and cytokines

3 讨论

3.1 人类巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒参与乳牙根尖周炎的发病机理

Sunde等(2008年)研究指出，HCMV和EBV的感染可参与到边缘及根尖周炎的发病过程中。Hernádi等[9]发现EBV DNA在根尖周炎病损的发生率要明显高于HCMV的发生率。Li等(2009年)发现与健康对照样本相比，EBV的DNA和RNA在原发性根尖周炎、治疗性根尖周炎和不可复性牙髓炎中的发生率显著性增高。然而，在往的研究中，HCMV在根尖周炎的发生率在0%～15.9%之间，而在本研究中，该病毒在儿童的乳牙根尖周炎中却有比较高的检出率。同时，在无病变乳牙的正常牙髓组织中，本研究没有检测到HCMV和EBV的阳性，这也与以往研究相一致[9]。两者相比之下，推测HCMV和EBV可能参与了儿童乳牙根尖周炎的发病过程当中。除此之外，很多以往的研究都是采用普通的PCR技术进行病毒的定性检测，而本研究采用了实时荧光定量PCR技术对病毒及细胞因子的表达进行定量，以便于分析其表达量是否与儿童乳牙根尖周炎的发病机理密切相关。

3.2 细胞因子的存在加剧根尖周炎的炎症反应

该研究发现HCMV和EBV能诱导细胞因子在病变乳牙的肉芽组织中高表达，两者呈正相关。这提示病毒感染之后，会导致细胞大量分泌和释放炎症因子，从而加重整个炎症反应过程。病毒DNA的存在预示着HCMV和EBV寄生于宿主细胞，其RNA的存在则表明其正在进行活跃的转录。HCMV和EBV在细胞间黏附分子表达，细胞粘附、激活核因子κB以及生成大量的细胞因子和趋化因子如TNF-α、γ-IFN、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、IL-2的反应过程中发挥着很明显的作用[7,10]。同时，疱疹病毒也会激发宿主产生一系列反应，甚至会导致吞噬细胞和白细胞功能异常，降低机体抵抗病毒入侵的免疫反应。以往研究发现，HCMV感染会刺激促炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α、γ-IFN等的生成。EBV感染也会刺激IL-1受体拮抗剂、IL-1β、IL-8、γ-IFN、TNF-α等的生成。特别是IL-6、γ-IFN和TNF-α具有高效的抗病毒活性。

通常，非特定菌群的多种细菌也会普遍存在于正常、无症状的以及有症状的根尖周。因此，细菌的感染也可能作为一个辅助因素来诱导细胞因子的表达，从而在乳牙根尖周炎的发病机理中发挥作用。但本研究并没有对细菌感染进行检测，主要关注于HCMV和EBV感染所引起的后果。

3.3 总结

本研究发现，在儿童乳牙根尖周炎的疾病中，伴随有HCMV和EBV的感染，而病毒感染会导致促炎症细胞因子的表达水平大大提高，两者之间具有明显的正相关性。这些病毒的感染及其诱导的组织破坏性细胞因子可能是儿童乳牙根尖周炎发生、发展的因素之一，它们在该疾病的发病机理中起重要作用。

[1]Hernádi K, Szalmás A, Mogyorósi R,etal. The prevalance of herpesviruses in human apical periodontitis samples[J]. Fogorv Sz,2012,105(4):135-140.

[2]Jakovljevic A, Andric M. Human cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in etiopathogenesis of apical periodontitis: a systematic review[J]. J Endod,2014,40(1):6-15.

[3]Ozbek S M, Ozbek A, Yavuz M S. Detection of human cytomegalovirus and Epstein-Barr Virus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions by real-time PCR[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2013, 18(5): e811-e816.

[4]Ferreira D C, Paiva S S, Carmo F L,etal. Identification of herpesviruses types 1 to 8 and human papillomavirus in acute apical abscesses[J]. J Endod,2011,37(1):10-16.

[5]Hernádi K, Gyöngyösi E, Mészáros B,etal. Elevated tumor necrosis factor-alpha expression in periapical lesions infected by Epstein-Barr virus[J]. J Endod,2013,39(4):456-460.

[6]Sabeti M, Kermani V, Sabeti S,etal. Significance of human cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in inducing cytokine expression in periapical lesions[J]. J Endod,2012,38(1):47-50.

[7]Jakovljevic A, Knezevic A, Karalic D,etal. Pro-inflammatory cytokine levels in human apical periodontitis: Correlation with clinical and histological findings[J]. Aust Endod J,2015,41(2):72-77.

[8]曾令芳.乳牙尖周病损中HCMV和EBV片段表达的研究[D].山东:山东大学, 2010:4-8.

[9]Hernádi K, Szalmás A, Mogyorósi R,etal. Prevalence and activity of Epstein-Barr virus and human cytomegalovirus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions[J]. J Endod,2010,36(9):1485-1489.

[10]Rechenberg D K, Bostanci N, Zehnder M,etal. Periapical fluid RANKL and IL-8 are differentially regulated in pulpitis and apical periodontitis[J]. Cytokine,2014,69(1):116-119.

[专业责任编辑：赵东方]

Expression of cytokines induced by HCMV and EBV in children’s deciduous teeth with periapical periodontitis

MA Guan-li1, CAI Zhang-cheng2, HU Wei-jie3, DONG Yan4

(1.DepartmentofStomatology,ChineseMedicineOrthopedicsHospitalofXiaoshanDistrictofHangzhouCity,ZhejiangHangzhou311200,China;2.DepartmentofStomatology,FirstPeople’sHospitalofLongwanDistrictofWenzhouCity,ZhejiangWenzhou325000,China;3.DepartmentofStomatology,People’sHospitalofTiantaiCountyofTaizhouCity,ZhejiangTaizhou317200,China;4.DepartmentofProstheticDentistry,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofZhejiangUniversity,ZhejiangHangzhou310009,China)

Objective To study the expressions of human cytomegalovirus (HCMV) and Epstein-Barr virus (EBV) and the expressions of tumor necrosis factor α (TNF-α), γ-interferon (γ-IIFN), interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 induced by them in children’s deciduous teeth with periapical periodontitis. Methods A total of 15 deciduous teeth with severe root apex disease were collected, and periapical granulation tissues were obtained to serve as experimental group. Meanwhile, a total of 15 normal deciduous teeth were collected, and pulp tissues were gained to serve as control group. Primers were designed and synthesized, and polymerase chain reaction (PCR) was conducted to detect the expressions of HCMV, EBV and cytokines. Results There were significant differences in the expressions of HCMV (χ2=17.368,P<0.05) and EBV (χ2=15.000,P<0.05) between experimental group and control group, and the differences in expressions of cytokines including TNF-α, γ-IFN, IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were also significant between two groups (Uvalue was 15.372, 16.014, 13.833, 10.416, 12.105 and 11.961, respectively, allP<0.05). In periapical granulation tissue samples, there was a remarkable positive correlation between herpesvirus (HCMV and EBV) and the expressions of TNF-α, γ-IFN, IL-1β and IL-12 (rvalue ranged 0.289-0.664, allP<0.05). Conclusion HCMV and EBV as well as the tissue-destructive cytokines induced by them may play an important role in the pathogenesis of children’s deciduous teeth with periapical periodontitis.

human cytomegalovirus (HCMV); Epstein-Barr virus (EBV); cytokines; polymerase chain reaction (PCR); periapical periodontitis

2015-09-06

马贯立(1985-)，男，住院医师，主要从事口腔临床相关工作。

董 研，博士后/主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.005

R781.34

A

1673-5293(2015)06-1122-04