徐慧君，谭细凤

（武警浙江总队嘉兴医院，浙江嘉兴314000）

·实验研究·

桔梗皂苷D联合多柔比星协同杀伤Hela细胞及其机制研究

徐慧君，谭细凤

（武警浙江总队嘉兴医院，浙江嘉兴314000）

目的探讨桔梗皂苷D是否能增强多柔比星对宫颈癌细胞的杀伤活性及机制。方法MTT法检测多柔比星单独治疗及联合桔梗皂苷D治疗对宫颈癌细胞系Hela的杀伤活性。用荧光定量PCR方法检测人正常宫颈上皮细胞系CRL-2614及宫颈癌细胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表达水平。将Hela细胞用桔梗皂苷D和多柔比星处理后，用荧光定量PCR方法检测Hela细胞PKM2的表达水平。将Hela细胞用桔梗皂苷D和多柔比星处理后，检测Hela细胞葡萄糖的摄取能力和乳酸生成能力。构建PKM2真核表达载体，MTT法检测PKM2表达载体转染对桔梗皂苷D联合多柔比星对Hela细胞活力抑制率的影响。结果对照组，1μmol/L桔梗皂苷D组，5μmol/L桔梗皂苷D组，10μmol/L桔梗皂苷D组，0.1 mg/L多柔比星组，0.5 mg/L多柔比星组，1 mg/L多柔比星组对Hela细胞活力的抑制率分别为0、（4.5±0.4）%、（21.2±1.8）%、（55.4±4.2）%、（7.0±1.1）%、（27.6±2.1）%、（60.8± 5.2）%，不同浓度桔梗皂苷D组间及多柔比星组间对Hela细胞的抑制率差异有统计学意义（P<0.05）。1μmol/L桔梗皂苷D对Hela细胞的抑制率为（4.1±0.4）%，0.1 mg/L多柔比星对Hela细胞的抑制率为（7.2±0.6）%，两者联合对Hela细胞的抑制率达到 （59.5±3.9）%。正常宫颈上皮细胞系CRL-2614及宫颈癌细胞系Hela、SiHa、C-33a的PKM2相对表达量为别为1.00±0.03、17.5±0.6、12.4±0.4、13.8±0.5，三种宫颈癌细胞系的PKM2表达量与CRL-2614细胞系相比差异均有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，桔梗皂苷D组的PKM2相对表达水平，葡萄糖相对摄取量及乳酸相对生成量均显著下降，且与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。转染PKM2表达载体后，桔梗皂苷D联合多柔比星对Hela细胞的抑制率从 （60.1±4.2）%下降到 （22.4±2.1）%，两者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论桔梗皂苷D通过下调PKM2的表达抑制肿瘤细胞的糖代谢，协同多柔比星杀伤宫颈癌Hela细胞系。

宫颈癌；桔梗皂苷D；丙酮酸激酶M2；糖代谢；Hela；多柔比星

宫颈癌是全球发病率第二位的妇科肿瘤，每年有超过50万患者被诊断为宫颈癌，化疗目前仍是治疗宫颈癌的主要手段[1]。多柔比星是一种抗肿瘤药物，通过抑制肿瘤细胞DNA/RNA的生物合成起到杀伤肿瘤细胞的目的，但肿瘤细胞的药物抵抗往往制约着多柔比星的临床应用[2]。因此，寻找其他的药物与多柔比星进行联合用药以增强多柔比星的抗肿瘤活性是目前肿瘤治疗研究的重点。本研究从2013年1月~2015年5月完成于本院实验室，研究的目的在于探讨桔梗皂苷D是否能增强多柔比星对宫颈癌细胞的杀伤活性，并研究其具体机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela、SiHa、C-33a及人正常宫颈上皮细胞系CRL-2614购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。所有细胞系培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并将细胞置于37℃恒温培养箱中培养，通入5% CO2。细胞每2~3天传代一次，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤2次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.1.2试剂 多柔比星， 噻唑蓝 [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium

bromide，MTT]购于美国Sigma-Aldrich公司，桔梗皂苷D购于美国Sigma-Aldrich公司（SMB00424）。DMEM培养基购于美国Gibco。Trizol试剂，逆转录试剂盒，pcDNA3.1，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen。葡萄糖检测试剂盒 （Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase assay kit）购于美国Molecular Probes公司，乳酸检测试剂盒（Lactate assay kit）购于美国BioVision公司。SYBR Green试剂购于日本TaKaRa。PKM2和GAPDH（内参）PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下:PKM2上游:5’-GCCTGGCGCCCATTACCA-3’，下游:5’-CCCACTGCAGCACTTGAAG-3’;GAPDH上游:5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′，GAPDH下游:5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。

1.2方法

1.2.1荧光定量PCR检测PKM2的表达 分别检测Hela、SiHa、C-33a以及CRL-2614中PKM2的表达水平，所有细胞的总RNA用Trizol试剂提取，之后用逆转录试剂盒按照说明书步骤进行cDNA的合成。以该cDNA为模板，在PCR体系中加入PKM2或GAPDH的引物，再加入SYBR Green试剂，按照SYBR Green操作说明书步骤进行PKM2基因的定量PCR实验，PKM2的相对表达由2-△△CT法计算[3]。

1.2.2Hela细胞葡萄糖的摄取及乳酸的检测 用葡萄糖检测试剂盒检测DMEM培养基中的葡萄糖浓度，用C0表示。将Hela细胞按1×104/孔接种在96孔板上，加入200μL DMEM培养基，在培养基中加入桔梗皂苷D及多柔比星处理2小时 （对照组不加药物处理2小时），按照试剂盒说明书步骤检测培养基中的葡萄糖浓度，用C表示，则各组葡萄糖绝对摄取量△C=C0-C。葡萄糖的相对摄取量可用以下公式计算：葡萄糖相对摄取量=（△C对照组-△C治疗组）/△C对照组。乳酸的相对生成量检测步骤及计算方法与葡萄糖相同。

1.2.3质粒构建及转染 将PKM2基因的开放阅读框架全序列（Gene ID:NM_001206796）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成pcDNA3.1-PKM2重组真核表达质粒[4]，质粒的转染使用Lipofectamine 2000按照试剂操作说明书步骤进行，将pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）转染入Hela细胞中，培养24小时。

1.2.4MTT法检测药物对肿瘤细胞杀伤活性 将Hela细胞按 5×103/孔接种在 96孔板上。将pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）转染入Hela细胞中，孵育24小时。然后再分别加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L桔梗皂苷 D及 0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L多柔比星培养48小时。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4小时。弃上清，在570nmol/L波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/OD对照组×100%。为了研究桔梗皂苷D对多柔比星的协同抗肿瘤作用，作者根据两者单独治疗对Hela细胞的杀伤活性来选择桔梗皂苷D及多柔比星的联合治疗浓度。选择桔梗皂苷D或多柔比星单独治疗仅轻微杀伤Hela细胞时的浓度作为两者联合的浓度。

1.3统计学处理 所有实验重复3次，实验数据用（）表示，并用SPSS 13.0统计分析软件进行处理，采用非配对双边t检验进行分析。

2 结果

2.1桔梗皂苷D与多柔比星对Hela细胞的抑制作用 桔梗皂苷D及多柔比星单独治疗对Hela的杀伤活性如表1所示。由于1μmol/L桔梗皂苷D或0.1 mg/L多柔比星仅轻微杀伤Hela细胞，因此选择这两个浓度的桔梗皂苷D或多柔比星进行联合治疗，探讨两者的协同效应。实验结果发现桔梗皂苷D联合多柔比星可协同杀伤Hela细胞，见表2。

表1 桔梗皂苷D与多柔比星对Hela细胞的抑制作用（）

与对照组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；与1μmol/L桔梗皂苷

组别 n/孔 细胞活力抑制率（%）对照组 3 0±0.1 1μmol/L桔梗皂苷D组 3 4.5±0.4▲5μmol/L桔梗皂苷D组 3 21.2±1.8**10μmol/L桔梗皂苷D组 3 55.4±4.2##**0.1 mg/L多柔比星组 3 7.0±1.1▲▲0.5 mg/L多柔比星组 3 27.6±2.1□□1 mg/L多柔比星组 3 60.8±5.2△△□□

表2 桔梗皂苷D联合多柔比星对Hela细胞的抑制作用（）

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与桔梗皂苷D组比较##P<0.01；与多柔比星组比较△△P<0.01

组别 n/孔 细胞活力抑制率（%）对照组 3 0±0.1桔梗皂苷D组 3 4.1±0.4*多柔比星组 3 7.2±0.6**联合治疗组 3 59.5±3.9##△△**

2.2宫颈癌细胞系PKM2的表达 三种宫颈癌细胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表达水平均显著高于人正常宫颈上皮细胞系CRL-2614，详见表3。

表3 宫颈癌细胞系上调PKM2的表达（）

与CRL-2614细胞比较*P<0.05

细胞系 n/孔 相对表达量CRL-2614 3 1.00±0.03 Hela 3 17.5±0.6*SiHa 3 12.4±0.4*C-33a 3 13.8±0.5*

2.3桔梗皂苷D显著下调Hela细胞PKM2的表达水平并抑制其糖代谢 选择1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星进行联合治疗，探讨两者联合对Hela细胞的协同效应。如表4所示，桔梗皂苷D能显著下调Hela细胞PKM2的表达水平并抑制其葡萄糖的摄取和乳酸的生成，而多柔比星则对PKM2表达水平及糖代谢无影响。

表4 桔梗皂苷D及多柔比星对Hela细胞PKM2表达及糖代谢的影响（）

与对照组比较**P<0.01；与桔梗皂苷D组比较##P<0.01；与多柔比星组比较△△P<0.01

组别 n/孔 PKM2相对表达水平 葡萄糖相对摄取量 乳酸相对生成量对照组 3 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.06桔梗皂苷D组 3 0.39±0.03**0.67±0.06**0.60±0.06**多柔比星组 3 1.01±0.07 1.02±0.06 0.97±0.05联合治疗组 3 0.40±0.04##△△0.65±0.06##△△0.61±0.05##△△

2.4过表达PKM2显著抑制桔梗皂苷D对多柔比星抗肿瘤作用的协同效应 选择1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星进行联合治疗，如表5所示，体外转染PKM2表达载体显著抑制桔梗皂苷D联合多柔比星对Hela细胞的协同杀伤效应。

表5 PKM2表达载体显著抑制桔梗皂苷D对多柔比星抗肿瘤作用的协同效应（）

与对照组比较**P<0.01；与联合治疗组比较##P<0.01

组别 n/孔 细胞活力抑制率（%）对照组 3 0±0.01联合治疗组 3 60.1±4.2**联合治疗+ pcDNA3.1-PKM2组 3 22.4±2.1##

3 讨论

桔梗皂苷D是桔梗总皂苷的主要活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节的作用，近期的文献报道，桔梗皂苷D还具有显著的抗肝癌和肺癌的生物活性，能诱导肝癌和肺癌细胞凋亡和周期阻滞[5-7]。在本研究中，作者同样发现桔梗皂苷D在较高浓度时（10μmol/L）有较好的抗宫颈癌活性，Hela细胞活力抑制率为（55.4±4.2）%，而更为重要的是，桔梗皂苷D在较低浓度时（1μmol/L）能联合多柔比星协同杀伤Hela细胞，提高化疗药物多柔比星对宫颈癌细胞的治疗效果，1μmol/L桔梗皂苷D对Hela细胞的抑制率为 （4.1±0.4）%，0.1mg/L多柔比星对Hela细胞的抑制率为 （7.2±0.6）%，两者联合后对

Hela细胞的抑制率达到（59.5±3.9）%。

肿瘤细胞的一个重要特征是与正常细胞相比，它们的糖代谢异常旺盛。肿瘤细胞能摄取更多的葡萄糖，但大部分葡萄糖却不进入氧化磷酸化释放能量，反而进行有氧糖酵解合成更多的中间产物，最后生成乳酸，而这些中间产物往往是合成核酸和蛋白质的原料[8]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是有氧糖酵解过程中的关键酶，肿瘤细胞PKM2往往异常高表达以促进有氧糖酵解的进行[9-10]。有文献报道肿瘤细胞的化疗药物耐药和肿瘤细胞的糖代谢异常有关[11-12]，因此作者进一步研究桔梗皂苷D对多柔比星的协同效应是否和肿瘤细胞的糖代谢有关。

首先作者通过实验发现三种宫颈癌细胞系（Hela，SiHa和C-33a）的PKM2表达水平均高于正常宫颈上皮细胞系CRL-2614 10倍以上，表明肿瘤的发生可能和PKM2的异常表达有关。进一步研究发现桔梗皂苷 D能显著降低 Hela细胞的PKM2表达水平并减弱Hela细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的生成，表明桔梗皂苷D能显著抑制宫颈癌细胞的糖代谢和有氧糖酵解。为了证实桔梗皂苷D联合多柔比星对宫颈癌细胞的协同杀伤效应依赖于PKM2的下调，作者构建了PKM2重组表达质粒，使PKM2在Hela细胞中过表达。作者发现当Hela细胞中的PKM2发生过表达后，桔梗皂苷D联合多柔比星对 Hela细胞的抑制率从 （60.1± 4.2）%下降到（22.4±2.1）%。所有这些结果都证实了桔梗皂苷D联合多柔比星协同杀伤宫颈癌细胞的机制是靶向于PKM2基因。

综上所述，桔梗皂苷D具有化疗药物增效的作用，其分子机制可能为通过下调PKM2的表达抑制肿瘤细胞的糖代谢以增强化疗药物对宫颈癌细胞的杀伤活性。这些实验结果为桔梗皂苷D与化疗药物的联合治疗方案提供了理论依据。

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