汪春年，李征，方建晨，王红卫

（宁波市临床病理诊断中心，浙江 宁波，315031）

卵巢浆液性腺癌血清miRNA差异表达及其临床意义

汪春年，李征，方建晨，王红卫

（宁波市临床病理诊断中心，浙江 宁波，315031）

目的探讨卵巢浆液性腺癌血清中差异表达的miRNA并分析其临床意义。方法使用基因芯片筛选差异表达的miRNA，6例卵巢浆液性腺癌患者和6例正常对照者血清，分别等量混合后作为浆液性腺癌组和正常对照组。通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）进行结果验证。结果与正常对照组相比，卵巢浆液性腺癌组血清中显著差异表达的miRNA有43种，其中上调的有25种，下调的有18种。RT-PCR验证了miRNA-22、miRNA-93在卵巢浆液性腺癌患者血清中显著上调，而miRNA-99b则显著下调，与芯片检测结果一致。结论卵巢浆液性腺癌和正常人血清中存在着差异表达的miRNA，提示miRNA与卵巢癌的发生发展有着密切的联系。

卵巢癌；浆液性腺癌；微小RNA

卵巢癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，早期不容易发现，多数发现时已出现广泛的浸润和转移，预后差。浆液性腺癌是卵巢癌主要类型之一，目前临床主要通过检测血中CA125水平筛查卵巢癌。近年来研究发现微小RNA（microRNA，miRNA）作为肿瘤抑癌基因或致癌基因来调节mRNA的转录和功能，在肿瘤的发生、发展和凋亡，以及在肿瘤的血管形成方面起到重要的调节作用。miRNA在人外周血中稳定表达，提示miRNA可能作为一种潜在的肿瘤标志物对肿瘤进行早期诊断。目前国内文献中，尚未见有关卵巢浆液性腺癌血清miRNA表达谱的研究，本文运用基因芯片技术将卵巢浆液性腺癌患者与正常人血清中miRNA进行比较，寻找其中差异性表达的miRNA，探讨其在卵巢浆液性腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 选择2013年1月~2014年8月宁波市医疗中心李惠利医院12例卵巢浆液性腺癌患者（FIGO分期为ⅠA和ⅠB期）血清样本以及12例正常妇女血清样本，实验组取样前未经过放疗、化疗及免疫等其他治疗。所有入选人群均知情同意后签署同意书并通过医院伦理委员会审查。每位入选者采取5mL静脉血，在30分钟内通过高速离心分离，将分离得到的上层血清样本转移至1.5mL离心管，13000 g离心2分钟，收集上清液。其中6例卵巢癌患者与6例正常对照的血清分别等量混合，进行miRNA基因芯片检测；其余各组6例血清样本分别于-80℃冻存，进行RT-PCR的miRNA验证。

1.2miRNA基因芯片检测和分析 实验由联川生物公司（http://www.lc-bio.com/）完成。使用LC Sciences基因芯片对混合血清进行了三次独立实验，利用激光扫描仪 （Gene Pix 4000B,Molecular Device）采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件（Media Cybernetics）进行图像数字化转换。差异倍数大于2倍定义为差异表达。

1.3实时荧光聚合酶链反应 （RT-PCR）验证miRNA通过基于SYBR GreenⅠ的荧光定量PCR。首先，使用Norgen血清/血浆外泌体RNA提取试剂盒进行RNA的采集和纯化。然后，来自血清的较小的RNA通过使用miScriptⅡRT Kit（Qiagen）生

成cDNA，使用ABI PRISM 7500 HT型荧光定量PCR仪进行实时PCR检测。所用引物见表1。

1.4统计学处理 采用统计软件SPSS17.0，所有的结果均用（）表示，进行成组t检验。

2 结果

2.1卵巢浆液性腺癌血清miRNA差异表达 通过基因芯片测定了两份混合血清标本中miRNA表达谱，基于差异倍数大于2倍为标准，结果发现43种差异表达的miRNA，其中25种miRNA上调，18种下调，见表2）。上调前5的miRNA分别为miRNA-22、miRNA-93、miRNA-4492、miRNA-2861、miRNA-21，下调前5的miRNA分别为miRNA-99b、miRNA-let-7a、miRNA-4267、miRNA-122-5p、miRNA-199a。

2.2血清miRNA-22，miRNA-93，miRNA-99b验证 为了进一步明确血清miRNA差异表达结果的可靠性，通过RT-PCR技术进行验证。独立的6份浆液性卵巢腺癌（FIGO分期为ⅠA和ⅠB期）和6例正常对照组进行血清miRNA荧光定量RT-PCR检测，结果见表3。浆液性卵巢腺癌患者血清中miRNA-22，miRNA-93明显上调（P<0.05），而miRNA-99b在浆液性卵巢腺癌血清中显著下调 （P< 0.05）。这与miRNA基因芯片研究结果一致。进一步分析发现，血清中miRNA-22、miRNA-93在卵巢癌不同分期（ⅠA和ⅠB期）中的表达差异有统计学意义（P<0.05），而miRNA-99b在卵巢癌不同分期中的表达差异无统计学意义，见表4。

表3 两组血清miRNA相对表达量比较（）

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

组别 n miRNA-22 miRNA-93 miRNA-99b正常对照组 6 1.18±0.66 0.75±0.22 1.03±0.29浆液性腺癌组 6 2.88±1.12**0.90±0.24**0.58±0.32*

表4 不同分期血清miRNA相对表达量比较（）

与ⅠA组比较*P<0.05

组别 n miRNA-22 miRNA-93 miRNA-99bⅠA 3 2.04±0.46 0.71±0.17 0.66±0.37ⅠB 3 3.72±0.90*1.10±0.07*0.51±0.31

3 讨论

卵巢浆液性腺癌是卵巢癌最常见的病理类型，它的发生发展是一个多基因参与、多步骤、复杂的过程。卵巢癌的早期诊疗是影响预后最重要因素。肿瘤标志物、肿瘤基因治疗靶点成为新的研究热点。目前国内外关于miRNA与卵巢癌的研究已经展开，并不断深入。

芯片技术诞生以来，因其能够在同一时间内高通量、平行检测大量基因的不同表达水平，所以被大量应用于肿瘤研究。通过比较组织基因表达差异，筛选和发现候选基因，为肿瘤早期诊断和治疗提供生物学依据。本研究通过基因芯片检测卵巢浆液性腺癌患者血清miRNA差异表达，结果显示，在肿瘤组和对照组间，一共有43种显著差异的miRNA，包括miRNA-22、miRNA-93、miRNA-4492、miRNA-2861、miRNA-21、miRNA-99b、miRNA-let-7a、miRNA-4267、miRNA-122-5p、miRNA-199a等，这为今后研究打下来一定的基础，为miRNA可能成为卵巢浆液性腺癌早期筛查的标志物提供了一定的实验依据。通过RT-PCR验证卵巢浆液性腺癌患者血清中miRNA-22、miRNA-93、miRNA-99b的差异表达，证实了肿瘤血清中miRNA与正常人间存在着差异。

本实验结果差异表达的43种miRNA与国内外研究报道基本一致[1-2]。但在某些卵巢癌组织或卵巢癌特定的细胞株中的研究结果与本文结果不甚一致。在以卵巢癌组织为研究对象中发现，与正常人类卵巢上皮细胞相比，miRNA-22在卵巢癌细胞中表达下调，并发现miRNA-22在晚期卵巢癌细胞中下调更明显[3]。miRNA-22被证明是卵巢癌转移的抑制因素[4]。这与本文在血清中的结果不一致，可能与标本类型不同有关。梁山辉等[5]报道，卵巢癌血浆中miR-22水平升高可能参与了卵巢癌的发生发展，miRNA-22与卵巢癌的侵袭转移密切相关，侵袭转移能力强的卵巢癌细胞中miRNA-22低表达，推测miRNA-22可能具有抑癌基因的作用。徐小丽等[6]报道，miRNA-22在乳腺癌中通过调控不同的靶基因，使其具有癌基因和抑癌基因双重作用，调控乳腺癌的发生发展和转移。本文结果显示，miRNA-22在卵巢癌血清中表达水平较正常人升高，且进一步分析显示血清中miRNA-22在卵巢癌不同分期中的表达差异具有统计学意义，故推测miRNA-22在卵巢癌中可能也具有多种不同的功能，预示着miRNA-22在卵巢浆液性腺癌发生发展中发挥着重要作用，有待以后进行大样本的更深入的研究。

本文结果显示，miRNA-99b在不同分期中的表达差异无统计学意义。miRNA-99家族主要是通过调节靶基因SNF2H，从而发挥其抑癌基因作用[7]。

本文结果表明，许多miRNA参与了肿瘤的发生发展，基因表达谱的差异使得每个患者具有不同的生物学特征。由于收集标本分级分期不同等原因，所获得结果可能与肿瘤发生的普遍规律存在差距，但是通过加大样本量，或许可以更好的筛选肿瘤差异表达基因。实验显示，众多miRNA在卵巢浆液性腺癌中出现差异表达，说明miRNA在卵巢浆液性腺癌发生发展中起到了一定的作用。

[1] Taylor DD，Gercel-Taylor C.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.Gynecol Oncol，2008，110（1）:13

[2] Resnick KE，Alder H，Hagan JP，et al.The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol，2009，112（1）:55

[3] Wyman S，Parkin RK，Mitchell PS，et al.Repertoire of microRNAs in epithelial ovarian cancer as determined by next generation sequencing of small RNA cDNA libraries．PLoS ONE，2009，4（4）:e5311[4] Li J，Liang S，Yu H，et a1.An inhibitory effect of miR-22 on cell migration and invasion in ovarian cancer.Gynecol Oncol，2010，119（3）:543

[5] 梁山辉，李俊，Maria Al-beit，等.卵巢上皮恶性肿瘤侵袭转移相关miRNA的筛选与鉴定.中华肿瘤杂志，2010， 32（9）:650

[6] 徐小丽，吴昌平，蒋敬庭.miRNA-22在乳腺癌中的作用及机制.国际免疫学杂志，2014，37（2）:87

[7] Mueller AC，Sun D，Dutta A.The miR-99 family regulates the DNA damage response through its target SNF2H.Oncogene，2013，32（9）:1164

宁波市自然科学基金项目（2013A610227）