王丽霞孙宝刚房 姣 曹井贺 粱鲁南 张 宁 杨爱军

济宁医学院附属医院（济宁 272000）

Y染色体微缺失对IVF/ICSI-ETSI-ET妊娠结局及后代出生缺陷的影响*

王丽霞△孙宝刚△房 姣 曹井贺 粱鲁南 张 宁 杨爱军

济宁医学院附属医院（济宁 272000）

摘要目的 通过分析少精子症和严重少精子症患者的Y染色体微缺失情况及其体外受精/卵胞浆内单精子注射（IVF/ICSI-ET）妊娠结局以及后代情况，探讨AZF微缺失对辅助生殖妊娠结局以及出生后代的影响。方法 实验组中488例少精子症和严重少精子症患者行Y染色体微缺失检测，将缺失携带者作为A组，将非携带患者作为B组。有正常生育能力，并有自然生育史的125例男性纳入对照组（C组）。对比A组、B组以及C组的妊娠结局和出生后代指标差异。结果 实验组中488例少精子症和严重少精子症患者中，Y染色体微缺失者共56例，均为AZFc微缺失，其中14例（25%）表现为少精子症，42例（75%）表现为严重少精子症。A组、B组和C组妊娠结局以及对子代影响的指标，3组间两两比较后均显示差异无统计学意义。结论 Y染色体微缺失对IVF/ICSI-ET治疗周期形成的妊娠结局以及出生后代无显著性影响。

关键词Y染色体微缺失; 男性不育; IVF/ICSI-ET; 妊娠结局

目前关于无精子基因（azoospermia factor, AZF）的研究主要集中在AZF微缺失与精子发生障碍的关系等方面，而AZF微缺失对IVF/ICSI-ET(in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection and embryo transplantation，体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植)妊娠结局以及对出生后代的影响鲜有报道。基于以上研究背景，我们通过分析少精子症和严重少精子症患者的AZF微缺失情况及其IVF/ICSI-ET妊娠结局及对后代的影响，为临床上对此类患者进行治疗措施的选择、遗传咨询和妊娠结局的预测等提供依据。

资料与方法

一、研究对象

收集在我院生殖医学科就诊的488例不孕不育男性患者，其中280例少精子症患者，208例严重少精子症患者。AZF微缺失者作为A组，无AZF微缺失者作为B组，以上两组为实验组。有正常生育能力，并有自然生育史的因女方输卵管因素就诊的男性（C组）纳入对照组。以上所有的研究对象均在自愿的前提下签署了知情同意书。

男性不育患者标准：精子浓度＜15×106/mL，总活力前向运动精子（PR）+非前向运动精子（NP）＜40%或PR＜32%；精子总数＜39×106/次；正常形态率＜4%， 精子浓度＜5×106/mL者为严重少精子症。排除染色体异常、免疫异常和感染等已知影响妊娠结局的因素，排除采用AID（intrauterine insemination with donor semen，供精人工授精）治疗患者。

女方筛选标准：染色体核型正常46, XX， 未发现已知的影响IVF-ET或ICSI-ET妊娠结局的疾病，[均通过子宫输卵管造影（hysterosalpinography, HSG）或者宫腔镜、腹腔镜手术以及超声检查证实]。

二、方法

（一）实验方法

1. 多重聚合酶链反应技术方法：用血液DNA 提取试剂盒提取DNA，运用多重PCR 技术检测Y染色体AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc 3个区域中的6个序列标签位点微缺失。每个样品做A组和B组两个多重PCR反应， A 组包括sY254、sY127、sY86 3个位点；B组包括sY134、sY84、sY255 3个位点。每组设置一对扩增SRY 基因（位于Y染色体短臂上的性别决定基因）的引物， 作为内对照。Y染色体微缺失试剂盒来自于上海透景生命科技有限公司。按照试剂盒操作说明扩增DNA， 扩增条件为: 95℃ 3min； 95℃30s， 59℃ 30s， 72℃ 30s， 35个循环， 最后72℃ 延伸10min。产物经琼脂糖凝胶电泳后， 用凝胶成像系统观察分析条带。

2. 精液常规分析：（1）计算机辅助精子分析（CASA） 采用计算机辅助精子分析仪(西班牙，SCA)检测精子密度、总数、各级运动精子百分率和数量等；（2）精子形态学分析（Diff-Quik法） 检测精子形态正常率=形态正常精子数/计数精子总数× 100%。

（二）遗传咨询

对所有Y 染色体微缺失检测结果阳性的患者均进行系统的遗传咨询，告知：如果选择ICSI 治疗，男性后代难以避免将再次面临同样的Y 染色体微缺失导致的生育问题； 另外的选择，包括PGD （preimplantation genetic diagnosis，种植前基因诊断）进行医疗性性别选择或供精人工授精。

（三）临床操作

1. 控制性超促排卵：A组与B组和C组女方均选择长方案超促排卵：于启周期前次月经黄体中期肌注达菲林（天津-益普生公司, 3.75mg）3.75mg，月经第3天开始使用促性腺激素（Gn）促排卵[果纳芬,默克雪兰诺, 5.5 μg (75 IU)]，月经第6天起，行阴道B超检查卵泡和子宫内膜发育情况，并以此及时调整用药。直至有2～3个主导卵泡直径在18mm以上时，结合激素检测结果提示卵泡发育成熟，停用促排卵药物，于当晚8点注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）5 000～10 000u。注射hCG后34～36h在阴道B超引导下穿刺取卵，记录取卵数。

2. 受精及胚胎培养：B组采用常规的体外受精：受精后18h观察原核，出现2个原核和2个极体为正常受精卵，未出现2PN为受精完全失败。取卵后培养72h观察胚胎形态，将优质胚胎移植到宫腔内。胚胎移植后14d检测尿或血hCG阳性，移植后4～5周超声检查见胎心搏动为临床妊娠。移植时先选择常规受精来源的胚胎，若无常规受精来源胚胎则移植ICSI受精胚胎。

3. 胚胎按以下评分标准分级：形态学指标 4’-卵裂球大小均匀，碎片为≤5%；3’-卵裂球大小均匀或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球体积相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2级胚胎在发育过程中出现下列情况，胚胎评级时在形态学基础上降一级：（1）授精20h内未见到原核，48h证实为延迟受精的胚胎。（2）取卵后48h超过8细胞或72h未超过5细胞。正常受精4、3级胚胎为优质胚胎。

（三）计算公式

受精率=正常受精卵数/卵-冠-丘复合体数× l00%；优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵数× l00%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期数× l00%；生化妊娠率= 生化妊娠周期数/移植周期数；流产率= 孕28周前流产周期数/临床妊娠周期数； 早产率= ART受试者在妊娠满28周至不满37周期间分娩周期数/分娩周期数。

三、统计学处理

实验数据采用SPSS 16. 0统计软件进行分析。计量资料用x±s表示，比较采用方差分析；计数资料用率（比值）表示，比较应用卡方检验。P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01差异有显著统计学意义。

结 果

488例少精子症和严重少精子症患者中，Y染色体AZF微缺失者共56例，均为AZFc微缺失。其中14例（25%）表现为少精子症，42例（75%）表现为严重少精子症。

一、AZFAZF微缺失与未见AZFAZF微缺失一般资料比较

比较A组与B组和C组患者：男、女方年龄、不孕年限、精液量、差异无统计学意义。精液参数中，精子浓度、前向运动精子率（PR）、正常形态率、精子存活率、C组高于实验组，差异有统计学意义，非前向运动精子率（NPR）A组和B组高于C组，差异有统计学意义，而A组与B组相比差异无统计学意义，见表1。

二、AZFAZF微缺失与未见AZFAZF微缺失与IVF-ETVF-ET或ICSI-ETSI-ET妊娠结局的比较

A组、B组以及C组受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率指标两两比较后显示差异无统计学意义，见表2。

三、AZFAZF微缺失对子代影响

A组和B组有Y染色体AZF微缺失56例患者。19者成功妊娠并分娩，其中男婴为11例。我们对其中8例男性后代行AZF微缺失检测，均发现为AZFc缺失，其中A组、B组以及C组流产率、早产率、后代出生体重、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率两两比较后显示无统计学差异，见表3。

讨 论

AZF最早于1976年被国外学者[1]发现，Y染色体长臂远端（Yq11）存在着控制精子发生的基因，并把这一区域称作AZF；1992年Vollrath等[2]发表了Y染色体图谱并借助特异性序列标签位点（STS）将Y染色体分为7区43亚区；1996年Voget[3]将AZF分为AZFa、AZFb、AZFc无重叠的3个区域。我们选取了AZF区的常见缺失基因对严重少弱精子或无精子患者进行常规筛查，这也是目前国内外诊治男性不育的共识[4, 5]。现在已经有大量的研究证实AZF缺失是一些严重少弱精子症和无精子症患者生精功能障碍的重要原因。AZF微缺失是男性不育的重要遗传学因素，其分子遗传学检测是临床常用的男性不育诊断指标之一。AZFc 区缺失， 临床表现多样化， 可以为正常精液、少精子或无精子的表现。我们研究也发现488例少精子症和严重少精子症患者中，Y染色体AZF微缺失者共56例，均为AZFc微缺失。其中14例（%）表现为少精子症，42例（%）表现为严重少精子症。

AZF缺失对IVF/ICSI-ET治疗结局，目前鲜有报道，且结果存在争议。van Golde等[6]研究Y染色体微缺失与无Y染色体微缺失ICSI治疗者比较，受精率、胚胎质量明显低于对照组，但胚胎种植率和活产率与对照组无明显差异，提示Y染色体AZFc微缺失影响ICSI治疗的受精率和胚胎质量。同样，Patrat等[7]、Kihaile等[8]、Choi等[9]及Guo等[10]的研究发现Y染色体微缺失的无精子症和严重少弱精子症患者行ICSI的受精率、卵裂率、优质胚胎形成率、囊胚形成率及妊娠率与年龄、常规精液参数匹配的无Y染色体微缺失的对照组相似。而Dewan[11]和Karaer[12]研究发现Y染色体的完整性在胚胎发育和维持妊娠中发挥着重要作用，而研究产生不一致的原因可能与选择的 STS 不同或与人种的差异有关。本研究通过分析AZF微缺失与无缺失的少精子症和严重少精子症患者的IVF/ ICSI-ET妊娠结局，探讨AZF微缺失对辅助生殖妊娠结局的影响。结果发现：AZF微缺失的携带者在接受IVF-ET或ICSI-ET治疗后，其受精率、着床率和临床妊娠率与AZF无缺失者相比无统计学差异，提示Y染色体AZFc微缺失对辅助生育妊娠结局无不利影响。这与我们早期的研究相一致[13]，我们对109例妻子不明原因流产男性患者进行检测结果发现：109例反复流产夫妇中Y染色体异常28例。Y染色体结构异常18例，数目异常2例，多态性变异8例。未发现存在Y染色体缺失的病例。

由于AZF微缺失多导致严重生精障碍，自然状态下难以使女方受孕生育子代，故在人群中发生父子间自然垂直遗传的几率罕见。而应用IVF/ICSI-ET技术则可以增加人群中发生父子间自然垂直遗传的几率。Oates等[14]分析了 AZFc微缺失携带者的临床指标和妊娠结局，发现AZFc微缺失的男性无明显躯体异常，精子发生比较稳定，一般通过射精或TESE可以获得活动精子。在他们的报道中，经过ICSI-ET治疗42.8%的AZFc微缺失携带者成功妊娠，其中男孩比例为55.5%，本研究中Y染色体AZF微缺失56例患者。19例患者成功妊娠并分娩，未发现有胎儿畸形，其他指标诸如流产率、早产率、后代出生体重、双胎妊娠率、男婴比例、与无AZF微缺失比较未发现差异有相关性。而通过IVF/CSI-ET技术出生的8位男性后代行AZF微缺失检测，均发现为AZFc缺失。由此可知AZFc微缺失的临床效应主要是精子质量的下降，AZFc微缺失对胚胎发育、机体代谢和男性子代一般躯体的影响不明显。AZFc微缺失可以由父亲遗传给男性子代，缺失片段的长度和类型基本一致，但是成年后同样会有精子发生障碍和不育的风险。因此对AZF微缺失携带者提供生育前的遗传咨询非常必要。应当通过PGD尽量选择女胚移植或改行AID进行治疗，切断遗传途径，以达到优生优育的目的。

综上所述， Y染色体微缺失对治疗周期形成的胚胎情况、妊娠结局以及出生子代无显著性影响。通过对AZF微缺失的研究，可以对IVF/ICSI-ET妊娠结局的影响做进一步了解，对患者的生育力进行合理评估，同时可以对Y 染色体微缺失检测患者进行更为系统的遗传咨询。由于AZF微缺失往往涉及多个基因，单个AZF相关基因的临床意义很难从AZF微缺失的临床表现上进行推断。因此对AZF微缺失的分子遗传学研究依然任重道远。

参 考 文 献

1 Tiepolo L, Zufardi O. Location of factors controlling spermatogenesisin the nonfluorescent portion of the human Y chomosome long arm. Hum Genet 1976; 34 (2): 119-124

2 Vollrath D, Foote S, Hilton A, et al. The human Y chromosome: a 43-interval map based on naturally occurring deletions. Science 1992; 258 (5079): 52-59

3 Vogt PH , Edelmann A , Kirsch S, et al. Human Y chromosome azoospermia factors ( AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996; 5(7): 933-943

4 Stahl PJ, Masson P, Mielnik A, et al. A decade of experience emphasizes that testing for Y microdeletions is essential in Americanmen with azoospermia and severe oligozoospermia. Fertil Steril 2010; 94(5): 1753-1756

5 韩潇, 刘睿智. Y染色体微缺失与男性不育. 中国生育健康杂志 2007; 18(3): 183-185, 189

6 van Golde RJ, Wetzels AM, de Graaf R, et al. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic menwith microdeletions in the azoospermia factor c region of the Ychromosome. Hum Reprod 2001; 16(2): 289-292

7 Patrat C, Bienvenu T, Janny L, et al. Clinical data and parenthood of 63 infertile and Y-microdeleted men. Fertil Steril 2010; 93(3): 822-832

8 Kihaile PE, Kisanga RE, Aoki K, et al. Embryo outcome in Ychromosome microdeleted infertile males after ICSI. Mol Reprod 2004; 68(2): 176-181

9 Choi JM, Chung P, Veeck L, et al. AZF microdeletions of the Ychromosome and in vitro fertilization outcome. Fertil Steril 2004; 81(2): 337-341

10 Guo T, Qin Y, Gao X, et al. The role of male chromosomal polymorphism played in spermatogenesis and the outcome of IVF/ICSI-ET treatment. Int J Androl 2012; 35(6): 802-809

11 Dewan S, Puscheck EE, Coulam CB, et al. Y-chromosome microdeletions and recurrent pregnancy loss. Fertil Steril 2006; 85(2): 441-445

12 Karaer A, Karaer K, Ozaksit G, et al. Y chromosome azoosper-mia factor region microdeletions and recurrent pregnancy loss. Am J Obstet Gynecol 2008; 199(6): 662. e1-5

13 孙宝刚, 曹井贺, 粱鲁南, 等. Y染色体异常与反复流产关系的初探. 中国男科学杂志 2013; 27(3): 54-56

14 Oates RD, Silber S, Brown LG, et al. Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome, and of 18 children conceived via ICSI. Hum Reprod 2002; 17(11): 2813-2824

（2014-10-24收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.003

中图分类号R 698.2

*基金项目资助：济宁医学院附属医院苗圃科研项目[JYFY-MP-2013-(ZD)-005]△为共同第一作者

The role of AZF microdeletion played in the outcome of IVF/ICSI-ET treatment*

Wang Lixia△, Sun Baogang△, Fang Jiao, Cao Jingheng, Liang Lunan, Zhang Ning, Yang Aijun
Affi liated Hospital of Jining Medical College, Jining, Shangdong 272000, China

AbstractObjective To evaluate the role of AZF microdeletion in spermatogenesis and its impact on IVF /ICSIET outcome. Methodsthods A retrospective analysis was conducted in 488 infertile couples requesting IVF or ICSI treatments. All the males were oligozoospermia or severe oligozoospermia. Multiplex polymerase chain reaction(M-PCR) was used to identify the microdeletions in AZF regions. 125 men with normal fertility and the natural history of fertility were set as the control group. The outcomes of IVF/ICSI-ET treatment were compared between the experience group with severe oligozoospermia or azoospermia and the control group(Group C). Resultssults Among the 488 males with oligozoospermia or severe oligozoospermia, 14 (25%) with oligozoospermia and 42 (75%) with severe oligozoospermia were found to have microdeletion in AZFc. There were signifi cant differences in the sperm functional parameters between the experimental group and the control group, but no significant difference between the AZF microdeletion carriers (Group A) and noncarriers(Group B).There was also no signifi cant difference in effect of pregnancy outcome and offsping among three groups. Conclusionusion The microdeletions in AZFc regions have not adverse effect on the outcome of ICSI-ET treatment for infertile males with oligozoospermia or severe oligozoospermia.

Key wordsords AZF microdeletion; male infertility; IVF/ICSI-ET; clinical outcome