严家来，孟德娣，张建军，陈雨京，朱先梅，张发苏

（安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601）

生物光学显微镜是一种精密的光学仪器，是一种重要的实验教学设备，对于形态学观察至关重要。经统计，在医学专业开设的病理学、组织胚胎学、临床检验基础、寄生虫学检验、血液学检验、微生物学检验及诊断学等涉及形态学课程中，实验教学使用显微镜的频率极高。能够熟悉显微镜的结构并熟练使用和维护好显微镜，是学生上好形态学实验课的前提[1]。笔者根据实验教学体会，对生物光学显微镜使用过程中的常见问题及解决办法进行分析。

1 显微镜的基本结构

双目电光源生物显微镜基本结构见图1[2]。熟悉显微镜结构是规范、熟练使用，克服、解决问题的基础。

图1 显微镜的结构

2 显微镜的主要性能

2.1 定位精度

指一物镜处在工作状态，用转换器转至另一物镜时，视野中心的偏移量。如用10×物镜调焦后，以其中心为基准，再转换至40×物镜时，中心位移不得超过该视场半径的2/3，以40×物镜为基准，转换至100×物镜时，中心位移不得超过该视场半径的3/4。

2.2 齐焦精度

指一个物镜调焦在工作位置后，转换到其他物镜时，应在不重新调焦的情况下就能看到物像。

2.3 焦点深度

指视野中垂直范围内所能清晰观察到的物象界限。当不用微调就能看清楚一个物像的平面及上下结构，这个能够看清的厚度即焦点深度。

2.4 镜口率

指光线从聚光镜经载玻片折射后所成光线底面的孔径数值，又称数值孔径。同样条件下，放大倍数越大，镜口率越低，光线越暗。

2.5 视野亮度

为了得到足够视野亮度，必须用强光源并开大光栅，使充足的光源进入物镜。同样条件下，物镜头放大倍数越大，镜口率越高，进入光线越少。因此，转换物镜头时应注意调整光线强度，使用油镜头时一定要添加香柏油。聚光镜抬高接近物镜头可以增加亮度，如果亮度已经足够甚至过剩，可以缩小光圈，或者下调聚光镜，但一般不降低底座光源强度，因为会使光源的颜色由白变黄，失去自然光属性，改变物像的颜色。下调聚光镜不仅可以降低亮度，还可以增加物像的对比度，使物像层次清晰。

3 显微镜使用三大原则

即先上后下，先高后低，先粗后细：（1）载物台的高度从上往下调节，可避免压碎载玻片；（2）物镜头转换先低倍镜后高倍镜，便于定位目标；（3）先用粗调节螺旋找到大致的焦点范围，再用细调节螺旋调节清晰的物像。

4 显微镜使用的常见问题及解决办法

4.1 光源灯不亮

电光源显微镜的好处是借助于底座强烈的光线把标本照亮，经适当的调节可以清楚看到物像，但有时会出现故障。光源灯不亮原因在于：（1）电源没接通；（2）插座插头未插好；（3）开关未开；（4）调节阀未开；（5）灯泡损坏；（6）保险丝损坏等。

解决办法：（1）使用带指示灯的电源插座，每次使用显微镜之前仔细检查是否接通电源。（2）将电源开关置于闭合状态，指示为“开”字或“ON”字。（3）检查调节电流强度（volume）的旋钮是不是处于最小处（minimum），一般此调节钮都是处于最高档，光源发出白色光。（4）底座光源的灯泡使用寿命较短，工作时间久了会自然损坏，应注意更换灯泡。养成随手关闭光源的习惯，使用前打开，不需预热，间隔5分钟以上不用就要关闭电源。（5）如果使用带延长线电源的插板，宜选用优质品牌，最好带通电开关和指示灯。（6）保险丝烧断，更换保险丝。

4.2 找不到物像

4.2.1 标本不在工作距离范围内 解决办法：调高载物台，载玻片与物镜头相接，慢慢下调，防止向下调节过快，没有捕捉到物像。

4.2.2 目标不在视野范围内 解决办法：（1）血细胞计数盘的划线区域一定要对准物镜头；（2）较少的标本，涂片区域较小，观察时要注意不要超出涂片范围。

4.2.3 光线过于强烈或太暗 解决办法：光线过于强烈，视野物像被“曝光”呈白色，适当降低光线强度，物像就会慢慢呈现出来。反之，用暗视野观察物像时，注意避免物像被黑暗掩盖。

4.2.4 聚光器偏离光轴 解决办法：进行合轴调节使光线在目镜、物镜、聚光镜、光栅这一光路的中心。

4.2.5 标本放反 在观察细胞形态时，如白细胞分类通常使用油镜观察，但血涂片经染色后，有的学生会把标本反放在载物台上。因为油镜头镜口率较小，需要标本非常接近油镜头，如果放反，物体超出了显微镜工作距离，无论如何也找不到物像。解决方法：（1）发现载玻片放反，直接翻转过来；（2）在制作载玻片时在其一端做标记，防止观察时放反。

4.2.6 观察到的物像不见了 虽然使用显微镜能观察到所要的物像，但一段时间后，却找不到刚才的物像。此时有两种情况：（1）显微镜的焦距仍正确，即视野内其他物像仍清晰；（2）显微镜的焦距发生了改变，视野中不再有任何清晰的物像。解决方法：出现第一种情况的原因是临时标本中的水较多，或显微镜镜身倾斜角度过大，或者两者兼而有之，使得标本中的物体在重力作用下向下移动，离开了视野范围。此时可以稍微向上调节载物台的高度，并将镜身直立。出现第二种情况的原因可能是由于粗准焦螺旋轴上的齿轮与镜筒上的齿条磨损松动，造成镜筒自动下滑，需要实验室技术人员修理。

4.3 视物模糊

视物模糊是由于光学系统受到污染，首先要判断出污物存在的位置，才能有效排除。视野中出现异物有3种情况：物镜上、目镜上和载玻片上。（1）移动载玻片异物不动，说明污物不在载玻片上；（2）转动转换器，换上高倍镜后，仍可观察到，说明污物不在物镜上，只可能存在于目镜上；（3）如果转动目镜头，污物也随之转动，则说明在目镜头上。

4.3.1 目镜头污染 解决办法：用乙醚乙醇混合液擦拭镜头表面，直到消除。如果是内部污染，则应谨慎，这多是由于不慎打开目镜头，灰尘、水汽进入造成，可以用干燥的纱布擦拭或洗耳球吹洗。平时注意保持室内干燥，防尘，避免从低温环境直接进入高温环境，防止形成冷凝水，发生霉变。

4.3.2 物镜头污染 解决办法：（1）标本加样不可太多，否则堆积在一起厚度较大，可以摊开平铺，扩大面积，也易于寻找，避免目标重叠；（2）在不违反规则的情况下用低倍镜观察，因为使用低倍镜时，物镜头距离观察目标尚有一段安全距离，可以避免标本接触物镜头；（3）加盖盖玻片，并且保持盖玻片上方面的干燥；（4）油浸镜头使用后应用擦镜纸蘸二甲苯及时擦拭，如果干结，清洁难度较大，应用擦镜纸沾湿清洁液浸润，擦拭时要用力。

4.4 机械故障

4.4.1 载物台卡死 有些显微镜的高倍物镜等焦处理不过关，导致在低倍镜下看清物像转换到高倍镜时，高倍镜与载玻片相碰，无法使用高倍镜[3]。解决方法：打开粗调节螺旋，将载物台上升到最高处，重新拧紧。

4.4.2 压碎玻片 当载物台上升到一定高度，载玻片与镜头“亲密接触”，已经超过了物镜头的弹性范围，最先受伤的只能是载玻片。解决办法：遵循载物台高度调节先上后下原则即可避免。

4.4.3 目镜头眼间距过小，不能双眼观察 出现这种情况主要是个别人眼间距太小，不能适应正常摆放的显微镜的目镜头的眼间距，但目镜头进一步缩小受镜架的阻挡，不能双眼观察。解决办法：可以把固定目镜的螺栓松动后旋转180°，重新固定，进一步缩小两目镜头的距离，适合眼间距窄的学生使用。

学生在使用显微镜的过程中出现问题在所难免，教师的任务是教会学生使用方法。除了在学生使用显微镜过程中出现问题能够及时发现并加以解决外，实验室工作人员对显微镜使用的登记管理及日常维护也是非常必要的[4，5]。