赵伟鹏 李 波 黄金昶

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

·研究报告·

加味乌梅丸诱导胰腺癌sw1990细胞NOD-SCID小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究*

赵伟鹏1李 波1黄金昶2△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

目的观察加味乌梅丸在体内诱导移植性人胰腺癌细胞凋亡的作用。方法将20只荷瘤小鼠分为对照组、用药组各10只。NOD/SCID小鼠皮下移植瘤造模成功后，用药组每日灌胃加味乌梅丸生药0.4 g/0.4 mL，对照组每日给予无菌注射用水0.4 mL。给药期间每5日测量并计算皮下移植瘤体积，绘制移植瘤生长曲线。20 d后处死小鼠，称取瘤质量，流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率，TUNEL染色标记细胞凋亡，观察细胞形态学改变。结果用药组移植瘤的体积的增长幅度明显小于对照组（P＜0.05）。加味乌梅丸对NOD/SCID小鼠移植性人胰腺癌瘤抑瘤率为22%，流式细胞分析用药组的早期凋亡率为（29.6833±0.76）%，与对照组（17.0167± 2.75）%相比，明显提高（P＜0.01），TUNEL法检测用药组肿瘤细胞凋亡指数（A1）为（59.4±19.3）%，与对照组的（19.2±7.4）%比较明显提高（P＜0.01）。结论加味乌梅丸可以通过促进肿瘤细胞的凋亡而发挥抑制肿瘤的作用。

乌梅丸 胰腺癌 细胞凋亡

胰腺癌是消化系统常见恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率明显上升。5年生存率＜1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。2010年美国一项调查研究显示胰腺癌已是癌症发病率第10位，死因第4位［1］，2006年发病率与死亡率均为第6位［2］。2012年最新数据表明，胰腺癌已是上海第5大肿瘤死因。其确诊时多属晚期，大多失去手术机会，而常规放化疗疗效欠佳。黄金昶教授及其研究团队运用加味乌梅丸治疗胰腺癌近20年，效果理想。通过诱导肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤是中医药治疗肿瘤的一个非常重要的途径。本研究旨在探讨在动物体内加味乌梅丸对荷瘤裸鼠胰腺癌细胞凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级NOD/SCID小鼠，雄性，3～4周龄，体质量（20±2）g，共20只，购自维通利华。购回后在中日友好医院临床研究所SPF级动物室普食饲养。

1.2 实验材料 细胞株sw1990购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤细胞库，复苏后接种于培养瓶中，在含10%小牛血清的RPMI1640培养液内常规传代培养。加味乌梅丸药物组成：乌梅50 g，当归20 g，细辛3 g，川椒6 g，桂枝10 g，黄连3 g，黄柏10 g，党参10 g，干姜10 g，制附片10 g，白芍30 g，生黄芪30 g，壁虎30 g，炒枳壳10 g，木香10 g等。中药饮品购自北京华邈中药工程技术开发中心，由中日友好医院药学部制备，常规水煎，水浴浓缩至生药含量为4.0 g/mL，4℃保存备用。TUNEL荧光标记试剂盒购自美国罗氏公司。流式细胞仪：BD FACSCantoⅡ。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司。

1.3 造模与分组 NOD/SCID小鼠移植瘤模型建立：人胰腺癌sw1990细胞株在含10%小牛血清的PRMI 1640培养液，37℃，5%CO2细胞培养箱内培养扩增，取对数生长期的5×107/mL细胞制成单细胞悬液，取0.1 mL接种于裸鼠右侧腋窝皮下，在SPF环境饲养下观察。成瘤率=瘤体积直径大于5 mm的小鼠数/该实验组的小鼠数×100%。等到小鼠移植瘤皮下可触及，肿瘤直径长到0.5 cm时，将荷瘤鼠随机分成对照组和用药组各10只。分组后用药组每日灌胃生药0.4 g/0.4 mL。对照组每日给予无菌注射用水0.4 mL。

1.4 实验方法 （1）瘤径测量。分组后，每5日测量瘤径1次，利用游标卡尺测量其最长径及其垂直径，计算肿瘤体积，公式为V=1/2ab2，绘制肿瘤生长曲线图。（2）瘤质量测量。给药20 d后处死小鼠，剥离瘤体，测量瘤块质量，计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组瘤质量-治疗组瘤质量）/对照组瘤质量×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 （1）取材将肿瘤组织置入RPMI1640培养液中，反复漂洗，冲净，剪成1～2 mm3小块，研磨，400目尼龙膜过滤，离心去上清，用10%小牛血清的PBS悬浮，移入EP管，加无水乙醇，离心细胞弃上清，PBS重悬细胞，再离心1次弃上清。（2）用预冷的1 mL PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于105），1000 g，4℃离心5 min。收集细胞。（3）加入400 μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。（4）加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。（5）加入10 μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 min。（6）在30 min内进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.6 TUNEL染色 （1）用二甲苯浸洗2次，每次5 min。（2）用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。（3）用Proteinase K工作液处理组织15～30 min在37℃8 min；（4）PBS漂洗2次。（5）制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μL TdT+450 μL标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50 μL标记的dUTP液，阳性对照组先加入100 μL DNase 1，反应在15～25℃×10 min，后面步骤同处理组。（6）玻片干后，加50 μL TUNEL反应混合液 （阴性对照组仅加50 μL标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1 h。（7）PBS漂洗3次。（8）玻片干后加50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30 min。（9）PBS漂洗3次。（10）在组织处加50～100 μL DAB底物，反应15～25℃× 10 min。（11）PBS漂洗3次。（12）拍照后再用苏木素复染，分化，自来水返蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.7 采集图象及图像分析 着色表达于细胞胞核，镜下（×100）下拍摄3个视野，将采集的图像应用Imagepro Plus 5.1图像分析系统进行分析，判断标准［3］分布，胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色，呈典型凋亡形态特征。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。采用t检验比较各指标差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 移植瘤造模成功 于NOD/SCID小鼠右侧腋窝皮下注射sw1990细胞后约1周，可触及皮下移植瘤形成，成瘤率100%。

2.2 肿瘤生长曲线 待瘤结节形成后，测量并计算瘤体积，绘制生长曲线图，移植瘤的生长曲线（图1）表明，对照组及用药组移植瘤的体积随着时间的延长而明显增加，但用药组移植瘤的体积的增长幅度明显小于对照组（P＜0.05）。

图1 移植瘤生长曲线图

2.3 瘤质量测量及抑瘤率 灌胃给药20 d后，麻醉脱颈处死小鼠，取下移植瘤，剔除局部坏死组织，用分析天平进行称重。两组移植瘤质量差异有统计学意义（P＜0.05），与移植瘤体积相一致，计算抑瘤率为22%。

组 别 样本数 瘤质量（g） 抑瘤率（%）对照组 1 0 0 . 9 7 ± 0 . 1 4 3用药组 1 0 0 . 7 6 ± 0 . 1 8 3 2 2 %

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 用药组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01），与瘤质量结果相一致。

组 别 样本数 各组早期凋亡率（%）对照组 1 0 1 7 . 0 1 6 7 ± 2 . 7 4 6 9 4用药组 1 0 2 9 . 6 8 3 3 ± 0 . 7 6 2 6 7

2.5 TUNEL检测细胞凋亡 用药组与对照组相比，差异具有统计学意义 （P＜0.01），与瘤质量结果相一致。见图2，图3。

组 别 样本数 各组凋亡指数（%）对照组 1 0 1 9．2 ± 7 . 4用药组 1 0 5 9 . 4 ± 1 9 . 3

图1 对照组TUNEL染色图片示凋亡细胞较少（×100）

图2 用药组见较多核染色呈深浅不一棕褐色的凋亡细胞（×100）

3 讨 论

加味乌梅丸为黄金昶教授治疗胰腺癌的常用方，临床观察发现服药后能很快改善患者的临床症状，尤其对患者的疼痛、食欲下降改善较明显，使不能行放、化疗的胰腺癌患者临床获益，生存期得到延长［4］，对本病中医可以从厥阴病论治，因厥阴病的提纲证和胰腺癌的常见症状极其相符。《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》提纲为“厥阴之为病，消渴，气上撞心，心中疼热，饥而不欲食，食则吐蚘。下之利不止”。而胰腺癌患者的常见症状则为上腹痛、上腹饱胀不适、食欲差、消瘦、乏力、腹泻或便秘，其中上腹饱胀不适、腹痛、食欲下降均符合厥阴病的临床表现。故在清上温下乌梅丸的基础上加用白芍，与当归合用补肝体，助肝用，且引药入肝经，加用生黄芪补一身之气，加用枳壳、木香理气止腹痛，加用壁虎祛风、软坚散结，且现代药理研究证实壁虎对多系统肿瘤均有明显的抑制作用［5］。

诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗肿瘤药物发挥作用的重要机制。1992年英国科学家Hickman JA［6］诱导肿瘤细胞凋亡可作为肿瘤治疗研究中的主要目标和手段，不但许多化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤，许多中药提取物复方也可提高肿瘤细胞凋亡率［7-8］。本研究在临床实践基础上，从动物实验及细胞水平证实加味乌梅丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制胰腺癌。肿瘤生长曲线及瘤重测量表明加味乌梅丸可抑制胰腺癌肿瘤生长，用药组移植瘤的体积的增长幅度明显小于对照组，瘤重测量显示，用药组瘤重明显小于对照组，抑瘤率为22%。流式细胞结果显示，用药组与对照组早期凋亡率有显著差异，用药组明显高于对照组，这与肿瘤生长曲线及瘤重测量结果相一致。早期凋亡启动了凋亡机制（包括线粒体膜电势的降低，细胞色素C进入胞浆，细胞内钙离子浓度上升等等现象），相对于晚期凋亡，它更有说服力。细胞凋亡起动之初，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）由质膜内侧翻向外侧，可与Annexin-V荧光素标记物特异结合，并通过流式细胞检测分析识别早期凋亡细胞。而细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，故合并使用鉴定细胞死活的核酸染料PI，即Annexin V-FITC/PI双染，借以区别凋亡细胞与死亡细胞。而TUNEL法可以检测各期的凋亡细胞，特异性和敏感性较高，且结合凋亡细胞的形态学特征加以判别，本实验中用药组凋亡指数明显高于对照组且出现大量典型的凋亡小体，排除了坏死灶，其结果与流式细胞学结果相符，进一步证实了加味乌梅丸通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤。

本研究仅从细胞学角度证实加味乌梅丸通过诱导细胞凋亡而抑制胰腺癌。诱导肿瘤细胞凋亡的机制有许多种，例如阻滞肿瘤细胞的增殖周期，影响细胞凋亡信号的转导途径，调控癌基因和抑癌基因的表达，而寻找与加味乌梅丸诱导胰腺癌细胞凋亡的相关的调控基因将是我们下一步的研究重点。

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［2］ 张思维，雷正龙，李光琳，等.中国肿瘤登记地区2006年肿瘤发病和死亡资料分析［J］.中国肿瘤，2010，19（6）：1-5.

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Apoptosis Induced by Wumei Pill in Pancreatic Cancer Cell sw1990 in NOD/SCID Mice

ZHAO Weipeng，LIBo，HUANG Jinchang.Beijing University of TCM，Beijing 100029，China

Objective:To study the effect of Wumei pill on the apoptosis of xenografts of human pancreatic cancer cell sw1990 in NOD/SCID mice.Method:20 tumor-bearing mice were randomly divided into control group and Wumei pill group.After the murine model of human pancreatic carcinoma was established，mice in two groups received either Wumei pill decoction 0.4 g/0.4 mL/d or sterile water 0.4 mL/d for 20 days.Measurement and calculation of tumor volume in mice performed every 5 days during the 20 days.At the same time，the tumor growth curve was drawn.After treatment of 20 days，the mice were executed.The weight of tumor was evaluated. The apoptotic rates were examined by FCM and given TUNEL labeling.Morphological changes were observed by microscopy.Results:The increase of xenograft tumor volume in Wumei pill group was less than that in control group.Compared with the control group，tumor growth was significantly inhibited by Wumei pill（22%）.Apoptotic index（A1）were significantly higher（29.6833±0.76）%determined by FACScan and（59.4 19.3）%by TUNEL in Wumei pill treatment group than those in the control group［FACScan（17.0167±2.75）%TUNEL（19.2 7.4）%］.Conclusions:Wumei pill can inhibit pancreatic cancer by inducing pancreatic tumor cell apoptosis.

Wumei Pill；Pancreatic cancer；Apoptosis

R285

A

1004-745X（2015）02-0194-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.003

2014-09-20）

北京市科学技术委员会重大项目（No.D131100002213004）

△通信作者（电子邮箱：zhaoweipeng1118@163.com）