周元元，杨嘉，卢伟，张鹏，朱姜，王帅

（扬州市产品质量监督检验所，江苏 扬州 225000）

0 引 言

双氰胺，又名二聚氰胺，二氰二胺。新西兰的部分农场将其用作硝化抑制剂，其目的是为了降低水中硝酸盐质量分数和减少温室气体排放，但是通过食物链的传递，双氰胺会到达奶粉中，最终进入人体中。新西兰检测了近2000个奶粉样品，有371个样品中检出双氰胺。在我国消费者对乳制品的安全特别重视和关注，因此有必要对奶粉中的双氰胺进行监测。

目前奶粉中双氰胺的检测方法主要是液相色谱-质谱法[1-2]，同时还有其他食品、药品、空气中双氰胺的检测报道，主要是液相色谱法和液相色谱-质谱法[3-6]。液质仪器价格昂贵，操作专业要求高，因此普及率不高。样品基质的差异使上述文献中的前处理方法无法满足奶粉样品的检测。本文通过对提取溶剂和色谱分离条件的优化，建立了高效液相色谱测定奶粉中双氰胺质量浓度的方法。

1 实 验

1.1 材料与试剂

双氰胺标准品（纯度99%），0.22 μm针式微孔滤膜过滤器，甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯，乙酸锌、亚铁氰化钾、三氯乙酸、氨水均为国产分析纯，实验用水符合GB/T 6682一级水要求。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器），涡旋混合器，Milli-Q Academic超纯水机，Sartorius CP225D型电子天平，SIGMA 3K15高速离心机，KQ-250E型超声波清洗器。

1.3 色谱条件

色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E氨基柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱温为40 ℃；进样量为10 μL；流动相：乙腈-水 (70∶30，体积比)，其中每100 mL水中添加25%氨水0.2 mL；流速为1.0 mL/min；检测波长为218 nm。

1.4 标准溶液的配制

准确称取适量双氰胺标准品，用甲醇溶解得到质量浓度为500 mg/L的标准储备液，用甲醇稀释标准储备液， 配制成质量浓度为0.008，0.02，0.08，0.4，2.0，4.0 mg/L的标准使用液，绘制标准曲线，确定线性范围。

1.5 样品处理

称取2 g均匀样品(准确至0.001 g)，置于50 mL具塞刻度试管中，加水10 mL，充分溶解后加入质量分数为1%三氯乙酸水溶液定容至满刻度，超声5 min后静置20 min,上清液经0.22 μm 水系滤膜过滤，供HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

双氰胺的极性较强，C18柱对其没有保留，需要使用离子对试剂，而后者对色谱柱有一定的伤害，并且检测重复性和重现性较差。氨基柱能用于分离极性较大的物质，根据双氰胺的性质，本实验选择了氨基柱作为分析色谱柱。

2.1.2 检测波长的选择

取质量浓度为2 mg/L的双氰胺标准使用液及待检样品处理液，在190～400 nm波长处进行扫描，发现双氰胺在218 nm处有较大吸收峰(图1)，且样品处理液杂峰少，因此选择218 nm作为检测波长。测定中采用了二极管阵列检测器对其进行光谱扫描，结合保留时间和扫描光谱图相似性进行定性。

图1 双氰胺光谱

2.1.3 流动相的选择

尝试了反相色谱分析中氨基色谱柱常用流动相乙腈和水的不同配比，结合标样色谱图峰型和样品处理液的分离效果 （图2和图3），确定了最佳的流动相条件。

2.2 提取方法的优化

图2 双氰胺标样色谱

图3 双氰胺奶粉样品色谱

参照双氰胺的溶解性，选择了甲醇、乙醇、乙腈、1%三氯乙酸作为提取试剂定容，并配合两种沉淀方法：（1）加水溶解样品后加入1.5 mL质量分数为10%亚铁氰化钾和1.5 mL质量分数为20%乙酸锌；（2）加水溶解样品后加入2 mL质量分数为20%乙酸铅，进行提取条件的优化。经过反复试验和加标回收试验发现不使用沉淀剂，直接用甲醇或质量分数1%三氯乙酸定容、振荡提取效果较好，且两种方法加标回收率差异不显著。考虑到质量分数1%三氯乙酸水溶液减少了有机试剂的使用，降低了实验人员与有机试剂的接触机会，对环境更加友好，因此选择1%三氯乙酸水溶液作为提取溶剂。

2.3 线性范围和检出限

参照“1.4”配制双氰胺标准使用液，按“2.1”色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制曲线，在质量浓度为0.008～4.0 mg/L范围内，标准品的质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系（图4），回归方程y=90.59x+2.7451，r=0.9998。将已知浓度标准品溶液不断稀释，当S/N为3时，最低仪器检出限为1 μg/L，方法的定量下限为0.08 mg/kg。

图4 双氰胺标准曲线

2.4 回收率和精密度

准确称取阴性对照奶粉进行加标实验，计算回收率和精密度。分别进行三水平加标测试，每个水平测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果如表1所示。由表1可以看出，不同添加水平下，回收率范围为84.7%～103.2%，相对标准偏差在2.29%～3.48%之间，完全可以满足日常分析的要求。

表1 加标回收率及精密度实验结果

3 结 论

本文建立了高效液相色谱法测定奶粉中双氰胺质量浓度的检测方法，方法精密度、回收率和检出限能满足实际样品检测的需要。样品前处理过程简单，不使用有机溶剂，无复杂的净化步骤，降低检测成本的同时也降低了检验人员的健康风险，对环境更加友好。二极管阵列检测器的使用降低了实验室检测的门槛，易于推广和应用，便于基层食品监管机构及时有效地对奶粉安全进行监控。

[1]黄芳，马叶芬，吴惠勤，等.液相色谱-串联质谱法快速测定奶粉中的双氰胺[J].分析测试学报，2013,32(3):271-274.

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[3]王祖翔，蒋俊，孙莉，等.高效液相色谱-串联质谱法测定食品中的尿素_缩二脲与双氰胺[J].分析测试学报，2012,31(5):593-599.

[4]马玉荣,张茹 ,秦莉伟.HPLC测定复方盐酸二甲双胍格列苯脲中3种有关物质[J].中国药事，2009,23(9):911-913.

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