刘芳，黄丹，陈永贵，樊江

（四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）

0 引 言

乳酸菌胞外多糖（EPS）是乳酸菌在其生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，因其重要的理论和实践意义，在医疗、食品、化妆品和酶技术等方面具有潜在的开发价值。现有研究表明，可生物合成胞外多糖的乳酸菌主要有：德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、米酒乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液链球菌嗜热亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌等[1]。但不同乳酸菌胞外多糖的合成能力差别很大，不同的营养基质和发酵条件其生物合成量也很不相同。本研究对保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的影响因素进行研究，旨在为高产胞外多糖乳酸菌的开发和应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

牛肉膏，蛋白胨，胰蛋白胨，酪蛋白胨，植物蛋白胨，酵母膏，D-半乳糖，麦芽糖，乳糖为生化试剂；葡萄糖、吐温80、乙酸钠、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯甲烷、正丁醇、乙醇（体积分数95%）、丙酮、苯酚、浓硫酸、蔗糖等为分析纯。

1.1.2 仪器设备

校CP114电子天平，YX-18HM手提式压力蒸汽灭菌器，BH200生物显微镜，GZ-250-HSI恒温培养箱，BCD-216TAM冰箱，TDL-5-A台式离心机，UV2400/PC紫外可见分光光度计，DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱，试管、锥形瓶、移液管等均为学院微生物实验室常规仪器。

1.1.3 培养基

MRS培养基[2]：用于菌种的活化、培养、保存和发酵。

1.1.4 试验菌种

保加利亚乳杆菌G6（本课题组从市售酸乳中筛选出的一株高产胞外多糖乳酸菌菌株，其胞外多糖产量为311.7 mg/L）。

1.2 方法

1.2.1 菌液吸光度的测定及活菌计数

将活化的保加利亚乳杆菌G6接种于MRS液体培养基中，37℃培养10 h后，取1 mL原液用无菌生理盐水逐级稀释，获不同浓度的稀释液，各稀释液于600 nm波长下测其吸光值，取适宜浓度的稀释液涂布MRS培养基平板，每个稀释度平行3次，37℃培养48 h后计菌落数，绘制吸光度与活菌数的关系图，通过吸光度的测定，在标准曲线上查找对应的活菌数，以此获得浓度为108mL-1菌悬液。

1.2.2 保加利亚乳杆菌G6胞外多糖质量浓度的测定

（1）生长曲线的绘制。乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌发酵产生的一种分泌于细胞外的次生代谢产物，是在对数期后期和稳定期产生的。本试验胞外多糖的测定时间为菌株达到稳定期的时间。将保加利亚乳杆菌G6按3%的接种量（浓度为108mL-1）接种于装有30 mL的MRS液体培养基中，于37℃恒温静置培养，每2 h于600 nm波长下测其吸光值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标作出保加利亚乳杆菌G6的生长曲线。

（2）胞外多糖的提取。取10 mL于37℃下培养至稳定期的发酵液，4 000 r/min离心15 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH将上清液调至7.5，加入1/10体积的胰蛋白酶液(浓度为3 g/L，现配现用)，40℃水浴酶解2.5 h。加入1/3体积Sevag液（氯仿：正丁醇(体积比)=3∶1），振摇30 min后，4 000 r/min离心15 min，去除沉淀，重复1次。加入3～5倍体积的体积分数为95%乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），4 000 r/min离心15 min，得沉淀。将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，干燥得白色粉末即为多糖（通过此种方法得到的为粗多糖）。

（3）胞外多糖质量浓度的测定。采用苯酚-硫酸法测定质量浓度，用葡萄糖绘制标准曲线[3]。EPS质量浓度的测定：准确吸取10 mL蒸馏水溶解胞外多糖样品，吸取样品溶液0.2 mL于试管中，然后按葡萄糖标准曲线制备步骤操作，测定样品的吸光度，由标准曲线的回归直线方程求出对应的糖浓度，再乘上样品稀释度即得保加利亚乳杆菌G6的胞外多糖浓度。

1.2.3 保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖影响因素的研究

（1）单因素实验。以MRS液体培养基为对照培养基，改变碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）、磷酸盐（磷酸氢二钾），其他配方不变，考察营养基质种类和质量浓度对EPS产量的影响；改变初始pH值、发酵温度、发酵时间，考察发酵条件对EPS产量的影响。每组培养基的配方和试验条件都取前面试验优化后的最佳营养要素和最佳发酵条件。

（2）正交实验。 实验设置4因素3水平，进行L9（34）的正交试验，4个因素均为单因素实验中对胞外多糖产量影响较大的因素，3个水平均取单因素实验的最佳值和左右值。其他实验条件不变，采用相同的方法测定胞外多糖产量，确定出高产胞外多糖的最佳工艺条件。

（3）验证实验。采用最佳工艺条件进行发酵，以相同的方法测定胞外多糖产量。平行3次，比较其EPS产量，并求出平均值。

2 结果与讨论

2.1 菌液吸光度与活菌数关系

菌液吸光度与活菌数关系如图1所示。由图1可以看出，不同浓度稀释液的吸光度与活菌数线性关系良好，通过测定各稀释液的吸光度，就可在标准曲线上查找对应的活菌数，以此获得浓度为108mL-1菌悬液，保证各发酵试验的接种量相对一致。

图1 吸光度与活菌数关系

2.2 生长曲线

保加利亚乳杆菌G6的生长曲线如图2所示。由图2可以看出，保加利亚乳杆菌G6延滞期较短，4 h后进入对数期，32 h后进入稳定期。本研究确定保加利亚乳杆菌G6产胞外多糖的发酵时间为40 h。

图2 保加利亚乳杆菌G6生长曲线

葡萄糖标准曲线如图3所示。

2.3 保加利亚乳杆菌G6产胞外多糖影响因素

2.3.1 不同碳源对EPS产量的影响

碳源种类的影响结果如图4所示。由图4可以看出，葡萄糖为保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最优碳源。葡萄糖质量浓度的影响结果如图5所示，由图5可以看出，当葡萄糖质量浓度为25 g/L时EPS产量最高。

图3 葡萄糖标准曲线

图4 碳源对EPS产量的影响

图5 葡萄糖质量浓度对EPS产量的影响

2.3.2 不同氮源对EPS产量的影响

氮源种类的影响结果如图6所示。由图6可以看出，蛋白胨为保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最优氮源。蛋白胨质量浓度的影响如图7所示，由图7可以看出，当质量浓度为10 g/L时EPS产量最高。

图6 氮源对EPS产量的影响

图7 蛋白胨质量浓度对EPS产量的影响

2.3.3 不同磷酸盐对EPS产量的影响

磷酸盐源种类的影响结果如图8所示。由图8可以看出，K2HPO4为保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最优磷酸盐源。K2HPO4质量浓度的影响结果如图9所示，由图9可以看出，当K2HPO4质量浓度为3.0 g/L时EPS产量最高。

图8 磷酸盐对EPS产量的影响

图9 K2HPO4质量浓度对EPS产量的影响

2.3.5 不同初始pH值对EPS产量的影响

初始pH的影响结果如图10所示。由图10可以看出，当pH值为4.5～6.0时，胞外多糖产量随pH值的升高而增大，当pH值为6.0～7.0时，胞外多糖产量随pH值的增大而减小，pH值为6.0时胞外多糖产量达到最高值。这是因为低或高的pH值，既不利于乳酸菌生长，亦不利于胞外多糖产量的积累。故本试验的初始pH值初步确定为6.0。

2.3.6 温度对EPS产量的影响

发酵温度的影响结果如图11所示。由图11可以看出，当温度小于36℃时，乳酸菌胞外多糖产量随温度的升高而增大，当温度高于36℃时，乳酸菌胞外多糖产量随温度的升高而减小。这是因为菌体在相对较低的温度下，细胞的生长和细胞壁的合成较慢，有利于胞外多糖的合成。故本试验的发酵温度初步确定为36℃。

图10 初始pH值对EPS产量的影响

图11 发酵温度对EPS产量的影响

2.3.7 不同发酵时间对EPS产量的影响

发酵时间的影响结果如图12所示。由图12可以看出，38 h以前随发酵时间的延长，胞外多糖产量增大，38 h以后随发酵时间的延长，胞外多糖产量随时间的延长而减小。可能是胞外多糖在菌株生长过程中会逐渐被分解成单糖补充碳源使菌株继续生长[4]。故本研究的发酵时间初步确定为38 h。

图12 发酵时间对EPS产量的影响

2.3.8 正交实验

由于氮源、磷酸盐质量浓度对保加利亚乳杆菌G6产胞外多糖的影响较小，故仅对葡萄糖质量浓度、发酵温度、初始pH值和发酵时间进行L9（34）的正交实验，结果如表1所示。以胞外多糖产量作为考察指标，确定出保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最佳工艺条件。

由表1可以看出，四因素对保加利亚乳杆菌G6产胞外多糖的影响大小为：葡萄糖质量浓度＞初始pH值＞发酵温度＞发酵时间。从K值可知，保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最佳工艺条件为A3B1C1D1，即葡萄糖质量浓度为30 g/L，发酵温度为34℃，初始pH值为5.5，发酵时间为36 h。

表1 正交实验结果

2.3.9 最佳工艺条件的验证实验

采用最佳工艺条件进行发酵，即配制葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氢二钾3.0 g/L，pH值为5.5的MRS液体培养基，于34℃静置培养36 h。平行3次，结果如表2所示。

表2 验证试验结果

由表2可以看出，保加利亚乳杆菌G6胞外多糖产量为425.7 mg/L，比优化前提高了36.57%。3次测定结果表明，此最佳工艺条件具有合理性和稳定性。

3 结 论

（1）对保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的影响因素进行了研究，在MRS液体培养基中，当葡萄糖、蛋白胨和磷酸氢二钾的质量浓度分别为30，10，3.0 g/L，而初始pH值为5.5，发酵温度34℃，发酵时间36 h时，该菌株胞外多糖合成量为425.7 mg/L，比优化前提高了36.57%。3次验证试验说明此工艺条件具有合理性和稳定性。

（2）实验证明，营养基质碳源、氮源和磷酸盐的种类和质量浓度对保加利亚乳杆菌G6产EPS都有不同程度的影响。不同的发酵条件，得到不同的胞外多糖产量。保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的发酵温度较低，菌体在进入稳定期后多糖产量最高，培养基在酸性环境下，EPS生物合成量较大。

（3）本研究可为高产胞外多糖乳酸菌的开发和应用提供理论依据。

[1]李泉阳,夏文水.乳酸菌胞外多糖的研究[J].食品与发酵工业，2003,29(05):86-90.

[2]凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999:85-86,117-124.

[3]张惟杰..糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999:11-12.

[4]孙军德,刘先.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化[J].沈阳农业大学学报，2010-02,41(01):90-93.