胡百卉 ，车津晶，许先兴，谌瑛，刘运龙，陈知航，程远国，许丽娜

1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130062；2.军事医学科学院 微生物与流行病研究所，北京 100071；3.第二炮兵总医院 药学部，北京 100088；4.吉林神话集团 通化玉圣药业有限公司，吉林 通化 134000

近几年，随着环境污染增加和生活压力增大，我国国民中癌症的发生率呈快速上升趋势。过去10年里，抗癌药物的研发取得了重大进展，尤其是生物制品的出现，增加了医生和患者对抗肿瘤药物的选择机会。传统的小分子化疗类药物通常存在非特异性结合靶点，因而可能产生严重的副作用；相反，具有靶向性特征的单克隆抗体药物一般具有非常强的特异性结合靶点，虽然诸如血小板减少、急性肾功能衰竭、免疫毒性、肺毒性和潜伏病毒感染的易感性等不良反应也偶有发生，但从整体而言其副作用相对较少[1]。人源化单克隆抗体已获准用于治疗癌症、炎症、自身免疫性疾病、传染病和修复移植排斥反应[2]，但单抗药物的药代动力学和药效学非常复杂[3]。

理想化的抗癌药物就是把具有良好的临床疗效的靶向特异性抗体和小分子药物结合，这就是抗体-药物偶联制剂（antibody-drug conjugate，ADC）。抗体-药物偶联制剂结构是具有靶向性作用的单克隆抗体与具有特定药理学特性（如细胞毒作用）的化合物结合。然而，利用单克隆抗体把一种化疗药物靶向到肿瘤细胞，在实际操作中是一项复杂的技术[4]。单克隆抗体必须与一种具有治疗作用的细胞毒素偶联，并且这种结合足够稳定，而不至于释放大量细胞毒素进入全身循环；如果结合不稳定，导致细胞毒素释放，最终会引起靶向细胞对毒素的内化[5]。同时，把细胞毒素偶联到单克隆抗体产生一种抗体-药物偶联物的制备过程，在偶联后应该保持该药物（抗体-药物偶联物）对靶点的识别[6]。

T-DM1 就是抗体偶联小分子药物，它结合了单克隆抗体赫赛汀（Herceptin，曲妥珠单抗）与trastuzumab emtansine（T-DM1）。曲妥珠单抗可靶向作用于乳腺癌和胃癌人表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2），而emtansine 是美登素（maytansine）的合成衍生物（美登素是一种小分子毒素，可与微管蛋白结合，通过非还原的双-马来酸亚胺-丙二醇联合体防止微管形成）[7]。曲妥珠单抗仅被批准用于HER2 阳性的癌症，但不能促使所有的HER2阳性细胞凋亡。T-DM1结合了选择性靶向HER2 受体的曲妥珠单抗与强效的细胞毒剂而杀死肿瘤细胞（不管HER2 是否诱导凋亡反应），即T-DM1 抗体与HER2 受体结合，引起从偶联物释放的美登素细胞内化，进而杀死肿瘤细胞。体内外研究显示，与曲妥珠单抗相比，T-DM1 具有较好的整体疗效和药代动力学特性，且毒性较低[8]。

鉴于抗体偶联药物的复杂性，常规方法难以满足对其的检测要求。本研究的目的在于建立一种灵敏度高、特异性好的T-DM1 检测方法，用于定量分析生物样品中的T-DM1含量。

1 材料和方法

1.1 材料

T-DM1（浓度20.8 mg/mL，于4℃保存）、抗DM1单抗（浓度9 mg/mL，于-80℃保存）由上海恒瑞医药股份有限公司提供；猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP购于BETHYL公司；脱脂乳购于BD医疗器械（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购于罗氏公司；TMB底物液购于阿拉丁公司；聚苯乙烯96 孔酶标板购于Costar公司；酶标仪购于BIO-RAD公司。

1.2 试剂配制

pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶于2 L ddH2O。封闭液：用PBS 配置5%脱脂乳。稀释液：用PBS 配置1% BSA 溶液。显色液：TMB 底物液A液与B液等体积混合。终止液：将20.8 mL硫酸缓慢加入100 mL 蒸馏水中，边加边搅拌。ELISA 洗板液：将0.5 mL Tween-20加入999.5 mL PBS中。

1.3 检测步骤

包被：用PBS 稀释抗DM1 单抗至10μg/mL，100μL/孔包被于96 孔板中，4℃过夜；封闭：洗板后，加入封闭液200μL/孔，室温封闭2 h；加样：洗板后，用20%猴血清稀释标准品和质控，100μL/孔加入96 孔板，室温孵育1 h；加二抗：二抗稀释至1/40 000，在洗板后以100μL/孔加入96 孔板，室温孵育1 h；显色：洗板后，加入显色液100μL/孔，室温避光孵育15 min；终止：加入终止液100μL/孔；读数：在酶标仪中读取D450nm值。

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围

将T-DM1 用20%猴血清梯度稀释至80、40、20、10、5、2.5、1.25及0.625 ng/mL，取100μL样品，按上述测定方法检测。以D450nm值为纵坐标、各标准管浓度为横坐标，对其进行非线形回归运算，所得回归方程即为T-DM1 的标准曲线。拟合曲线见表1、图1。经四参数Logistic 函数模型拟合，求得曲线斜率、EC50，及上下端渐进线间的近线性范围。

2.2 方法的灵敏度与最低检测浓度

按照制备标准曲线的方法制成0.625 ng/mL 的T-DM1，同样按上述方法进行测定，重复6 次，由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为TDM1 的检出量。标准品回收率试验满足批内CV＜20%的检测下限（LOQ）为0.625 ng/mL。见表2。

表1 标准曲线与线性范围

图1 T-DM1的四参数校正曲线

2.3 方法的精密度与准确度

按上述方法测定40、5、1.25 ng/mL 高、中、低3个浓度，每个浓度平行测定6次，共测定3次，分别计算批内与批间的CV值与RE值。结果见表3，3 种浓度水平批内与批间CV值均小于10%，检测方法具有较高的精密度；同时，3 种浓度水平测定批内与批间RE值均小于10%，检测方法具有较高的准确度。

2.4 方法的特异性

按照制备标准曲线的方法制成终浓度为45 ng/mL的T-DM1样品，在其中加入PEG-EPO（促红细胞生成素）、IL-2（白细胞介素2）、IFN-α2a（α2a 干扰素）和GH（生长激素），在标准曲线范围内进行测定，每样品重复6 次，检测结果见表4。T-DM1 与EPO、IL-2、IFN-α2a和GH 没有发生交叉反应，T-DM1 测定结果没有受到影响。

表2 ELISA方法检测加入猴血清中受试物的灵敏度

表3 ELISA方法检测加入猴血清中受试物的T-DM1精密度与准确度

表4 受试药加入PEG-EPO、IL-2、IFN-α2a和GH后的回收率

表5 T-DM1的稳定性

2.5 样品的稳定性

猴血清中T-DM1 的稳定性研究结果见表5，TDM1 在血清中冻融3 次，或室温放置4 h、30 d、90 d，或-80℃长期保存，均不影响其稳定性。

2.6 样品稀释率的影响

用20%猴血清将25μg/mL 浓度的T-DM1 标准液分别稀释至1/20 000、1/5000和1/625，每个稀释率6 个样品进行测定，结果见表6，不同的稀释率对样品检测无影响，不存在稀释效应。

上述方法学确证结果表明，我们建立的ELISA方法的特异性、板内和板间精密度、LOQ、回收率、稳定性及样品稀释率的影响均满足生物样品分析要求，可用于T-DM1的药代动力学研究。

3 讨论

研究表明ADC 在治疗实体瘤方面仍存在较大问题。实体瘤的细胞被致密的基质包裹，抗体难以穿透这一屏障。大多数实体瘤都存在淋巴回流障碍，导致间质内压力升高，阻碍了抗体进入肿瘤实质；而小部分进入实体瘤内部的抗体，首先遇到的是血管周围的肿瘤细胞而被结合，使得抗体无法到达距离血管较远的肿瘤细胞[9]。因此，目前应用抗体药物治疗大体积实体瘤的效果仍不理想。ADC类药物下一步的发展目标必定是增加其肿瘤血管特异性，使其充分进入肿瘤细胞[10]。

生物制品分析方法通常开始于创建适当的制造工艺，然后通过其确认目标产品（起初是单克隆抗体，然后是抗体-药物偶联物）的正确结构和功能[11]。监管机构提出的对生物制品分析要求，包括对其分子结构、乙二醇微观不均一性、杂质、降解产物和生物利用度的研究。

表6 样品稀释率的影响

抗体-药物偶联物的3 个主要组成部份（单克隆抗体、连接器和细胞毒素）都需要充分满足某些特点，因此评价批次差异将会异常复杂[12]。根据欧洲药品管理局（EMA）的生物仿制药指南，“每一种单克隆抗体都是独特的，结构也会有微小的改变，进而显著影响其功能，即使是在同样的表达系统和相似的培养条件下，也可能会产生一个不同特性的产品（例如，杂质和微观不均一性）”[13]。

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