秦玺 ，徐小洁，饶春明，高凯，杨琦，史新昌 ，于雷 ，周勇 ，杨玉帅，程龙，叶棋浓，王军志

1.中国食品药品检定研究院 生物制品检定所，北京 100050；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

随着全球工业化、城市化的加速，各种致癌因素不断增多，肿瘤已成为威胁人类生命的最大杀手。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据《2013中国肿瘤登记年报》统计显示，乳腺癌居女性恶性肿瘤第一位，占女性所有肿瘤的16.97%，每年新发病例约21万。microRNA（miRNA）是重要的基因调节因子，它参与细胞分化、增殖、凋亡、胰岛素分泌，以及心脏、大脑和骨骼肌的发育过程[1-5]。雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）属于核受体家族，通过与其配体雌激素（E2）的结合，激活启动子中含雌激素应答元件（ERE）的基因表达，包括周期蛋白D1、组织蛋白酶（cathepsin，Cat）D、c-myc、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、Bcl-2/BclXL、血管内皮生长因子（VEGF）等。ERα水平或由其介导的信号转导功能的改变，会导致细胞生命活动的紊乱，诱发乳腺癌等癌症[6-12]。我们通过转染多个miRNA的表达载体，发现miR-424能够抑制ERα的表达水平，为下一步研究miRNA在ER信号通路中的生物学功能及阻抑乳腺癌的进程奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞MCF-7、ZR75-1，细胞裂解液购自天根生化科技有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；质粒提取试剂盒购自Promega公司；ERα抗体、CatD抗体和GAPDH抗体购自Sigma公司；SDS-PAGE胶和PVDF转膜系统购自Invitro⁃gen 公司；miRNA-424、miRNA-497、miRNA-429、miRNA-219表达载体由军事医学科学院放射医学研究所郑晓飞教授馈赠；miRNA-424抑制剂购自QIAGEN公司。

1.2 Western印迹

转染48 h后收集细胞，加入细胞裂解液及SDS加样缓冲液，煮沸15 min，12 000 r/min离心2 min，上清液进行SDS-PAGE，电泳后将胶转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，用ERα抗体（1∶1000）孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，将含辣根过氧化物酶的ECL底物滴于膜上反应5 min，吸干后用X线胶片显影。

1.3 生长曲线

24孔板的每孔中加入约2000个细胞，转染后分别在24、48、72、96和120 h收集细胞；在细胞悬液中加入MTT，于37℃孵育4 h；加入脱色液，37℃至少静置30 min，使甲质颗粒充分溶解；转入96孔板孔中，在酶标仪上读取D570nm值，每个点为3个平行样品的平均值。

2 结果

2.1 抑制ERα表达的miRNA筛选

6 cm2皿中接种ZR75-1细胞，待细胞生长到70%～90%时，将miR-424、miR-497、miR-429、miR-219及对照分别转染细胞，转染后6 h换为新鲜培养基，48 h后收集细胞，裂解细胞后，进行Western印迹，用ERα抗体检测ZR75-1细胞中内源ERα的表达。结果发现，与对照组相比，miR-424能够抑制ZR75-1细胞中内源ERα的表达，而转染miR-497、miR-429、miR-219的实验组ERα的表达不变（图1）。为了进一步确定miR-424对ERα表达的作用，在ZR75-1细胞中转染miR-424抑制剂，降低细胞内miR-424水平后，ERα表达得到提高（图2）。综上，说明miR-424能够降低ZR75-1细胞中ERα的水平。

2.2 miR-424能够降低ERα及其下游基因CatD的水平

图1 Western印迹检测多个miRNA表达载体对ZR75-1细胞内源ERα表达的影响

6 cm2皿中接种ZR75-1细胞，待细胞生长到70%～90%时，分别转染miR-424和对照质粒，转染后6 h换为新鲜培养基，并分为加E2组与不加E2组，48 h后收集细胞，裂解细胞后进行Western印迹实验，分别用ERα抗体和CatD抗体检测ZR75-1细胞中内源ERα及其下游基因CatD的表达。结果见图3，与阴性对照组相比，miR-424能够明显抑制ERα及CatD的水平；E2能够促进ERα及CatD的表达，但对miR-424抑制ERα和CatD的作用没有影响。说明miR-424能够抑制ERα及其下游基因的表达，且miR-424对ERα及其下游基因的抑制作用并不依赖于E2的参与。

2.3 miR-424抑制乳腺癌细胞ZR75-1的生长

24孔板中接种ZR75-1细胞，待细胞生长到70%～90%时，分别转染miR-424和阴性对照质粒，转染后6 h换为新鲜培养基，并分为加E2组与不加E2组，分别在24、48、72、96、120 h后收集细胞，进行细胞生长曲线实验。结果见图4，与对照组相比，miR-424能够抑制ZR75-1的生长；E2能够促进ZR75-1细胞的生长，但在转染miR-424的实验组，E2并不能回复miR-424对ZR75-1细胞生长的抑制作用，进一步表明，miR-424对ERα的抑制作用并不依赖E2的参与。

图2 Western印迹检测多个miR-424抑制剂对ZR75-1细胞内源ERα表达的影响

图3 Western印迹检测miR-424对ZR75-1细胞内源ERα及下游基因表达的影响

图4 CCK-8法检测miR-424对ZR75-1细胞生长的影响

3 讨论

miRNA是一类调控基因表达的非编码内源性小RNA分子，广泛存在于哺乳动物、线虫、果蝇和植物等生物中，长度为19～25个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3'非编码区完全或不完全结合，抑制蛋白的翻译或降解mRNA[13-14]，在转录后水平调控基因的表达。miRNA在肿瘤的发生发展过程中是作为癌基因还是抑癌基因发挥作用，取决于它们调控的靶点[15]。miRNA与肿瘤的关系紧密[16-18]，肿瘤的发生总伴随有多条miRNA的表达异常，这给肿瘤的诊断和治疗开辟了一条新的途径[19-23]。但目前，在肿瘤中关于miRNA的研究大部分停留在其表达水平的异常，而对miRNA的表达调控及其与转录靶mRNA和作用靶点的特异性对应关系尚知之甚少。

在乳腺癌癌变前及发生癌变的组织中，ERα表达的正常调控遭到破坏，表现为表达水平的显著提高或发生对雌激素敏感性的改变。目前，乳腺癌内分泌治疗主要通过降低ERα的转录活性来实现，然而长期的内分泌治疗却又会使肿瘤细胞对抗雌激素药物等产生抗性。在本研究中，miR-424对乳腺癌相关基因ERα及其下游基因有明显的抑制作用，并且阻碍了ERα阳性乳腺癌细胞株ZR75-1的生长。通过miR-424在转录后对ERα及其下游基因的调节，实现了对ZR75-1细胞的生长抑制。该结果对于开发运用于诊断和治疗ERα阳性乳腺癌患者的新分子标志物提供了线索，为进一步研究阻抑乳腺癌进程和治疗有重要启示，并提供了新的方向。

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