娄文静，张道军，史云，崔家骏，吴志豪，戚丽华，靳连群，刘雪林，宋宏彬，张传福

军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

H7N9亚型禽流感是甲型流感病毒中的一种，自暴发以来，在多个国家时有流行和散发，对养禽业造成了严重损失。2013 年我国出现首例人感染H7N9亚型禽流感病毒事件[1-2]；截至目前，共报道143例确诊病例，分布于北京、上海、江苏、浙江等12 个省市，其中死亡45人，病死率高达31.5%[3]。因此，通过对今年暴发的人源H7N9 亚型禽流感病毒与禽源H7N9亚型病毒的基因同源性和系统进化分析，继而研究监测并寻找对抗该病毒的方法是当务之急。

甲型流感病毒基因组是分为8 个节段的单股负链RNA，其中第8 段非结构蛋白基因是其基因组中最小的基因节段，编码非结构蛋白NS1和NS2[4]。NS1 存在于病毒感染的细胞中，在正常病毒粒子中不存在，经灭活疫苗免疫的动物也不会产生。因此，针对NS1 的抗体可能只在流感病毒的宿主中存在，据此可以区分灭活疫苗免疫动物和野生型毒株感染动物[5]。此外，NS1 还具有抑制宿主蛋白合成、通过与宿主蛋白相互作用来增强病毒的致病性和毒力[6]、拮抗干扰素（IFN）产生及通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PKR）-IFN 途径和PI3K 激活途径下调感染细胞凋亡[7]等功能。上述特点使NS1 在甲型流感病毒的检测和抗病毒研究中有着广阔的应用前景。

基于以上背景，我们克隆、表达了人源甲型流感病毒H7N9亚型NS1基因，为进一步研究其功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因组cDNA 由本实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）、克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、Taq酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、T4DNA 连接酶、小量提取质粒试剂盒购自TaKaRa 公司；原核表达载体pET28a 购自Invitrogen 公司；DNA marker 购自Fermentas公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 NS1基因的扩增

根据GenBank 报道的A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）株NS1基因序列设计PCR 引物，上游引物为5'-CCCATATGGGAGATATACCATGGGCA-3'（划线部分为引入的NdeⅠ限制性酶切位点），下游引物为5'-GGAATTCCCGGAGCTCGAATTCTTA-3'（划线部分为引入的EcoRⅠ限制性酶切位点）。扩增程序：94℃预变性30 s；94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30 个循环；72℃延伸5 min。将扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 目的基因的克隆

从琼脂糖凝胶中回收PCR 产物，将纯化的PCR产物片段与pMD18-T 克隆载体连接成重组质粒pMD18-T-NS1，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取白斑进行PCR鉴定，对阳性克隆进行序列测定，测序结果在NCBI网站在线比对分析。

1.4 重组表达质粒的构建与鉴定

将pMD18-T-NS1、pET28a 质粒分别用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切，用T4DNA 连接酶将酶切后的NS1基因与pET28a载体连接，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，构建重组表达载体pET28a-NS1，经酶切鉴定后，挑选阳性克隆质粒送中科西林生物有限公司进行基因序列测定，并进行序列分析。

1.5 NS1蛋白的诱导表达与表达产物检测

挑取经鉴定的阳性单克隆于5 mL LB（Kan+）培养基中，37℃振荡培养过夜，次日以1∶50 的比例转种，扩大培养至菌液D600nm达0.5～0.7 时，加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG，于37℃诱导表达2～3 h 后取菌液，12 000 r/min 离心5 min，弃上清，沉淀用PBS反复洗涤2 次，取1.5 g 菌体沉淀，用15 mL 菌体裂解液重悬，间歇超声波冰浴破菌后，12 000 r/min离心 5 min，分别收集上清和沉淀，经12% SDSPAGE分析重组蛋白的表达形式，考马斯亮蓝染色。

1.6 Western印迹鉴定NS1蛋白

将SDS-PAGE 凝胶蛋白电转移至PVDF 膜，经封闭液封闭后与1∶500 稀释的His 单克隆抗体反应45 min，用含0.05% Tween-20 的PBS（PBST）洗涤3次，再与羊抗鼠IgG-HR 酶结合物室温反应1 h，PBST充分洗涤后浸入底物显色液中观察颜色区带。

2 结果

2.1 NS1基因的序列分析及系统进化树分析

从GenBank 获 得2006～2013 年不同 来源的H7N9 型病毒，包括2013 年在我国上海、安徽、江苏、浙江、福建、广东、台湾等地暴发的H7N9 亚型禽流感病毒的NS1序列，用MEGA 5.0构建NJ进化树（图1）。从拓扑结构来看，A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）与其余H7N9 型病毒分离株的NS1基因序列分为2 个进化分支。根据获得的NS1基因核苷酸序列及推导的编码氨基酸序列进行同源性比较，A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）株与2013 年暴发的H7N9 型禽流感病毒NS1基因的核苷酸同源性仅为68.5%～70.6%，氨基酸序列同源性为51.1%～96.3%；与2007～2012 年暴发的H7N9 型禽流感病毒NS1基因的核苷酸同源性为70.5%～71.7%。

进化树表明，2013 年的H7N9 亚型分离株都属于基因群A 群，而2007～2012 年的分离株属于基因群B 群。2013 年我国的H7N9 病毒分离株（A 群）其NS1基因存在以A/Wuxi/1/2013（H7N9）为代表和以A/Guangdong/1/2013（H7N9）为代表的2 个不同的亚分支；而2013 年中国大陆的H7N9 型禽源分离株其NS1基因都属于A/Wuxi/1/2013（H7N9）为代表的分支，尚未发现属于A/Guangdong/1/2013（H7N9）分支的2013 年禽源H7N9 病毒分离株。根据获得的NS1基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列进行同源性比较，以A/Wuxi/1/2013（H7N9）为代表的分支的病毒分离株NS1核苷酸同源性为99.2%～100%，氨基酸同源性 为98.5%～100% ；以A/Guangdong/1/2013（H7N9）为代表的分支的病毒分离株NS1基因的核苷酸同源性为95.0%～96.6%，氨基酸同源性为94.3%～98%；同源性比较结果表明，2013 年的H7N9 型病毒分离株NS1基因高度保守。由B 群分离株的进化分支来看，2008 年的危地马拉分离株、2009 年的江西分离株、2009 年的捷克分离株、2011 年的韩国分离株等属于不同的进化分支，说明H7N9 型禽流感不仅具有时间相关性，而且具有地域相关性。

图1 H7N9流感病毒NS1基因进化树

2013 年暴发的H7N9 型禽流感病毒分离株（A群）与2007～2012 年暴发的H7N9 病毒分离株（B 群）属于不同的进化分支，两者间NS1基因的核苷酸同源性为86.4%～90.7%，氨基酸序列同源性为72%～87.3%。A 群与B 群在进化上的显著差异暗示甲流病毒变异速度快这一特征，说明今年暴发的人源H7N9 型禽流感与之前暴发的禽源H7N9 型禽流感在进化上有显著区别。因此，对同一种H7N9 型禽流感病毒的不同地域、亲缘关系的研究，有助于进一步了解病毒的进化特征，为未来基于NS1 蛋白的抗病毒药物及疫苗的研发奠定基础。

2.2 NS1基因的扩增及克隆质粒鉴定

以A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因组cDNA为模板，用设计的特异性引物扩增NS1基因全长，扩增片段与预期大小相符。重组克隆质粒pMD18-TNS1 转化菌的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约680 bp 处可见特异性条带，与预期相符。测序结果与A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）株NS1基因序列一致。

2.3 重组表达质粒的鉴定

提取重组质粒pET28a-NS1，经限制性内切酶EcoRⅠ/NdeⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳得到2 个片段，其中小片段与目的基因片段大小相符（图2），测序结果表明，NS1基因以正确的方式插入pET28a 载体中，且序列正确。

图2 重组表达质粒的酶切产物电泳图

2.4 NS1蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析

含pET28a-NS1 重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）经0.5 mmol/L IPTG 诱导后超声波裂解，SDS-PAGE 分析（图3）表明有相对分子质量为25×103的蛋白表达，与预期一致，而未经IPTG 诱导的对照样本则没有预期蛋白表达。从图3可以看出，NS1融合蛋白在菌体裂解后的上清和沉淀中均有，但主要以包涵体形式存在。

2.5 表达蛋白的特异性鉴定

为了验证相对分子质量为25×103的蛋白带是否由NS1基因表达，用Western 印迹进行了表达产物的特异性检测，结果如图4，IPTG 诱导样本有特异条带，而未加IPTG 诱导的大肠杆菌未见特异条带，证明该蛋白带系NS1基因表达产物。

3 讨论

自1988年在美国明尼苏达州首次发现H7N9亚型禽流感以来[8]，陆续在多个国家和地区有该病发生的报道，该型病毒在家禽和水禽中广泛存在，已对养禽业造成了严重损失[9]。2013 年我国首次出现H7N9 亚型禽流感感染人的现象，截至目前已造成45人死亡[10]。2013 年10 月，浙江省又出现2例人感染禽流感病例。因此，对该病毒的研究应当予以重视。目前，相关研究多侧重于H7N9 病毒血凝素，而对非结构蛋白及其基因的研究较为少见。非结构蛋白只在病毒感染的细胞中合成，并未包装进病毒颗粒。在病毒感染早期，非结构蛋白就在病毒中大量表达且积聚在细胞核内，形成致密的晶体样包涵体，在感染晚期的细胞浆内也有存在，刺激机体产生抗NS1 蛋白的抗体[11]。现有研究表明，NS1 蛋白在抑制宿主细胞蛋白质合成、增强病毒mRNA 翻译的效率、诱导细胞凋亡和抑制干扰素等方面具有重要作用。因此，拮抗NS1蛋白的功能，对抑制甲型流感病毒的复制和限制病毒传播具有良好的应用价值[12]。

图3 SDS-PAGE检测pET28a-NS1在大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达产物

图4 表达产物的Western印迹

我们扩增了A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）分离株的NS1 基因，并与从GenBank 下载的其他H7N9病毒分离株的NS1基因片段序列和蛋白序列做了对照分析，发现H7N9 流感病毒的NS1 基因分为A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）独立分支和基因群A、B 群，其中A、B 群两群群内的核苷酸序列同源性分别为95%～100%和92.1%～100%，而两群之间的核苷酸同源性仅为86.4%～90.7%。同源性比较表明，2013 年H7N9 禽流感病毒分离株同源性高达95%以上，在进化上高度保守，与之前的H7N9型病毒分离株有明显的进化区别。

随着天气转冷，人感染H7N9 禽流感病例可能会继续出现。此外，目前禽间病毒传播并未得到控制，且禽类感染H7N9 病毒后很难发现，难以在早期控制禽类疫情[13]。因此，对H7N9禽流感进行监测是预防与控制其暴发的一个重要环节。我们以此为出发点，扩增了人源H7N9 亚型禽流感病毒的NS1基因，对其进行基因克隆，在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了NS1 融合蛋白，重组蛋白可以与流感病毒的NS1蛋白单克隆抗体反应。这一结果有助于研究H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白的活性、对疫苗免疫和野毒感染的动物诊断，并为以NS1 蛋白为基础的抗病毒药物的研制奠定了基础，为将来有效地进行禽流感的监测工作迈出了关键一步。

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