程然然，闫永红，弓蒙蒙，曹培丽，贺福初,，王晓晖

1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京蛋白质组研究中心 蛋白质组学国家重点实验室，北京 102206

细胞分裂周期蛋白26（cell division cycle 26，CDC26）是细胞周期后期促进复合物（cell cycle anaphase-promotingcomplex，APC）家 族 成 员 。CDC26基因是编码泛素连接酶的基因之一，通过编码细胞中泛素连接酶来调控细胞周期蛋白的合成与分解，以实现细胞周期性的分裂与增殖分化[1-2]。CDC26和APC6连接后，可以对细胞周期蛋白的降解产生作用[3]。

目前对CDC26基因的研究报道不多，大多都是对CDC25和CDC42基因所控制的其蛋白家族的研究[4-6]。RNA干扰（RNA interfering，RNAi）是近年发展迅速的一项生物技术，已成为基因功能研究和基因治疗的强有力工具[7]。我们以短发夹RNA（short hair RNA，shRNA）腺病毒为介导，构建靶向干扰CDC26基因的表达载体，为CDC26基因功能的研究提供相关技术手段和积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

人293A细胞株、HeLa细胞株、小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）、大肠杆菌Top10菌株、穿梭载体pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30、腺病毒载体pAd/pl-DEST均来自北京蛋白质组研究中心分子遗传学实验室；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；Gateway体外重组系统、PEI转染试剂、TRIzol购自Invitrogen公司；DNA快速纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Promega公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。

1.2 穿梭载体pENTRY-CDC26-shRNA的构建和鉴定

参考小鼠CDC基因（GenBank：NM_139291.3）设计CDC26基因的靶向shRNA序列（TGCTGTTGACA GTGAGCGCAGCTCAAGCTCGACGACATTGTAGTGAAGCCACAGA TGTACAATGTCGTCGAGCTTGAGCTTTGCCTACTGCCTCGGA）及对照组shRNA序列（为GFP的靶向序列，命名为S000）（TGCTGTTGACAGTGAGCGAAACGTCTATATCATGGCCG ACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTCGGCCATGATATAGACGTTGT GCCTACTGCCTCGGA）。

本研究避开了传统的PCR扩增靶向shRNA序列，而是依据DNA双链互补性质将目的序列分割合成，而后以退火连接的方式构建其载体。CDC26序列拆分如下：

A：tcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgCAGCTCAAGCTCGACG ACATTG；B：ttcactaCAATGTCGTCGAGCTTGAGCTGcgctcactgtca acagcaatataccttc；C：tagtgaagccacagatgtaCAATGTCGTCGA GCTTGAGCTTtgcctactgcctcgg；D：aattccgaggcagtaggcaAAG CTCAAGCTCGACGACATTGtacatctgtggc。

S000对照组以同样的方法拆分，由华大基因有限公司（北京）合成。A和B退火，C和D退火，退火产物直接暴露有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，无须再次酶切。将2段退火产物与pENTRY-EF1a-EGFPMir30（XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收）载体用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，卡那霉素（Kan）抗性选择阳性克隆，提质粒，送华大基因有限公司进行测序鉴定。

1.3 重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA的构建

将测序鉴定正确的pENTRY-CDC26-shRNA载体用Gateway体外重组系统重组到pAd/pl-DEST。Gateway反应体系（10 μL）包括6 μL TE（pH8.0）、1 μL pENTRY-CDC26-shRNA（100 ng）、1 μL pAd-DEST（150 ng）、2 μL LRⅡ重组酶。室温反应1 h，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，氨苄西林（Amp）抗性选择阳性克隆，提取质粒用EcoRⅠ酶切鉴定。

1.4 重组腺病毒的包装与扩增

将正确的重组子用PacⅠ酶切线性化，乙醇沉淀法回收，用PEI转染293A细胞，24 h后观察GFP的表达，培养7～10 d后在显微镜下观察细胞空斑病变，当细胞中出现病变且视野中局部或全部为绿色荧光时，表明重组腺病毒在293A细胞中包装成功。当部分细胞开始变圆并脱落时，收集细胞及其培养液，于-80℃与37℃反复冻融3次裂解细胞以释放病毒颗粒，4000 r/min离心10 min，取上清于-80℃保存，将回收到的病毒原液感染新的293A细胞，扩增病毒，回收备用。

1.5 病毒滴度的测定

准备生长良好的HeLa细胞，消化计数稀释至1×105/mL，加入6孔板，1 mL/孔；将3个稀释度（10-2、10-3、10-4）的病毒加入6孔板，24 h后观察病毒感染细胞的荧光数量[8]，利用流式细胞仪检测病毒滴度。

1.6 CDC26 shRNA重组腺病毒在细胞内的表达及干扰效果鉴定

基础细胞培养液加10%胎牛血清（FBS）培养MEF，其密度达90%时用已知滴度的病毒液感染细胞，24 h后观察GFP的表达情况，以确定重组腺病毒是否感染MEF。收集感染的实验组细胞与对照组（S000）细胞，TRIzol法提取总RNA，并反转录形成cDNA。采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测CDC26基因mRNA的表达情况[9-10]。以β-actin为内参，用NCBI Primer Blast设计各组的定量检测引物CDC26-F（5'-TGCAGAGGCCTGAAAAGAGATTT-3'）、CDC26-R（5'-ACTCCTCAATGTCGTCGAGC-3'）、 β-ac⁃tin-F（5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'）和 β-actin-R（5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'）。用 2-ΔΔCt法进行相对定量分析，检测CDC26基因mRNA的表达情况。

2 结果

2.1 穿梭质粒pENTRY-CDC26-shRNA的克隆

将克隆好的CDC26与对照组S000入门质粒进行测序鉴定，证实所设计的shRNA序列已正确插入pENTRY-EF1α-EGFP-Mir30载体。

2.2 重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA的构建

pAd-CDC26-shRNA载体经EcoRⅠ酶切，结果与理论预期相符（图1），表明成功构建了腺病毒重组载体pAd-CDC26-shRNA。

2.3 重组腺病毒的包装

带有GFP标记的线性化pAd-CDC26-shRNA及对照组pAd-S000-shRNA载体转染293A细胞8 d后，在显微镜下观察到细胞病变，且GFP充满视野中的绝大多数细胞，表明腺病毒包装成功（图2）。

2.4 病毒滴度测定结果

用流式细胞仪检测3个浓度梯度的细胞荧光产生情况，结果见图3，阴性对照组无荧光产生，其余3组（10-2、10-3、10-4）都产生了不同层次的荧光数目。假定每一个细胞内只有一个病毒进入，则根据公式及10-2管的病毒感染率可计算出病毒初液的滴度（UT/mL）=0.835×1.18×106×100/0.9=1.09×1010。

2.5 CDC26 shRNA重组腺病毒在细胞内的表达及干扰效果

用已知滴度的病毒感染3代以内的MEF，24 h后在荧光显微镜下观察，可见视野中有大量绿色荧光（图4），说明重组腺病毒成功感染了MEF。收集各组细胞进行实时荧光定量PCR检测，结果表明荧光定量PCR引物具有很好的溶解曲线（图5），表明PCR引物特异性良好。被感染了病毒的细胞其相应的基因扩增率仅为26.85%，可计算出设计和构建的shRNA对细胞中CDC26基因的抑制率为73.14%（图6），表明成功构建了具有较高敲低效果的shRNA腺病毒载体。

2.6 CDC26 shRNA重组腺病毒在小鼠肝脏内的干扰效果研究

用已知病毒滴度的腺病毒，尾静脉注射6～8周雄性C57/BL6小鼠，1010/只，对照组和实验组各5只，注射1周后测量小鼠空腹血糖。结果发现，与对照小鼠相比，注射CDC26 shRNA的小鼠的血糖值明显降低（图7），表明CDC26在小鼠体内血糖的维持中起重要作用，同时暗示了CDC26在糖代谢过程中的重要作用。

3 讨论

CDC26是APC家族中的一员，由位于小鼠4号染色体上的CDC26基因编码，对调控细胞周期具有重要作用。目前有关APC家族的研究主要集中在CDC25和CDC42上[11]，对CDC26的研究报道较少。

图1 pAd-CDC26-shRNA重组质粒的酶切鉴定

图2 重组腺病毒包装过程中的细胞病变效应及GFP表达（×40）

图3 流式细胞术检测pAd-CDC26-shRNA重组腺病毒滴度

图4 重组腺病毒感染MEF（×40）

图5 实时荧光PCR引物特异性的溶解曲线

图6 构建的shRNA敲低CDC26 mRNA的RT-qPCR检测结果

图7 病毒注射7 d后C57/BL6小鼠的空腹血糖值

为了进一步研究CDC26在细胞中可能发挥的作用，我们设计了CDC26基因的shRNA。鉴于腺病毒具有感染效率高、宿主广泛、容易制备表达、不整合入染色体、表达效率高等优点，我们选择构建CDC26基因的shRNA腺病毒载体。通过限制性内切酶分析及碱基序列测定，证明构建了重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA。我们在293A细胞中包装了重组腺病毒。RT-qPCR检测结果显示，感染pAd-CDC26-shRNA腺病毒的MEF中CDC26基因的mRNA表达明显减少，证明靶向shRNA表达成功。我们还发现CDC26敲低后小鼠的血糖值会明显降低。以上结果为下一步机制研究奠定了基础。

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