王建红，郭心灵，赵会君，罗朝阳，侯旭锋，2，赵 瑾＊

（1.河南大学 天然药物与免疫工程重点实验室，河南 开封 475004；2.许昌学院 化学工程学院，河南 许昌 461000）

铜是人体内必需的微量元素，能参与多种生理过程并发挥重要作用［1-3］.它通过与金属硫蛋白结合来影响一些生物酶（如过氧化物歧化酶，细胞色素氧化酶，酪胺酸酶等）的活性，在细胞呼吸作用、氧化防御及神经递质传递等过程中显示生物活性［4-5］.研究表明，人体内铜元素水平与多种疾病如心血管疾病、糖尿病、癌症和神经退行性疾病等密切相关［6-9］，因此设计、合成能够识别和检测生物体内Cu2＋的荧光探针对于相关疾病的诊断具有重要意义.

荧光探针检测金属离子具有方便、快捷、灵敏度高、对样品无损害等优点，因而显示出广阔的应用前景，特别是在环境污染、生物检测等领域的应用受到广泛的关注［10-14］.目前，已报道的Cu2＋选择性检测荧光探针母核主要有荧光素类、罗丹明类、菁染料类及萘酰亚胺类等［15-17］.香豆素类化合物具有荧光量子产率高、荧光发射波长适中、斯托克斯（Stokes）位移大、光稳定性好等优点，特别需要指出的是其还具有良好的膜透性和良好的生物相容性，使得香豆素类荧光探针的设计、合成成为一个新兴的研究热点.

本文中作者基于分子内电荷转移（Intramolecular Charge Transfer，ICT）理论，在香豆素母核上引入邻羟基芳香亚胺结构，利用金属离子对邻羟基亚胺的配位作用实现离子识别［18］.目标化合物形成的O-N-O金属配合中心，能选择性配位Cu2＋.当Cu2＋与其配位后，氮原子上的孤对电子被金属离子束缚，因而不能发生光诱导电子转移，导致体系的荧光猝灭.在合成探针3的基础上，利用荧光滴定光谱实验研究了探针识别Cu2＋的选择性及灵敏度，并初步验证了探针的识别机制.荧光探针的合成路线如图1所示.

图1 荧光探针3的合成路线Fig.1 The synthetic route of probe 3

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker ultraflextreme MALDI-TOF-TOF质谱仪、奥利龙Model 420pH计、Varian Cary Eclipse荧光光谱仪、Shimadzu UV-2350紫外光谱仪、VarianINOVA-400型核磁共振仪、X-6精密熔点测定仪.

2，4-二羟基苯甲醛、乙酰谷氨酸、醋酸酐、4-二乙氨基水杨醛、硝酸盐等均为市售分析纯，光谱测定所用溶剂为色谱级（阿拉丁试剂有限公司），金属离子溶液、HEPES缓冲溶液均按照标准方法配制.

1.2 3-氨基7-羟基香豆素的合成

将2，4-二羟基水杨醛（2.76g，20mmol）、乙酰谷氨酸（2.34g，20mmol）、无水醋酸钠60mmol加入100mL醋酸酐溶液中，加热回流反应6h，反应液倒入碎冰（300mL）中得到黄色絮状沉淀，抽滤，用冰水洗涤滤饼，剩余物在30mL HCl与乙醇的混合溶剂（V（HCl）∶V（乙醇）＝2∶1）中加热回流1h，然后将溶液倒入冰水（100mL）中，加入30%NaOH调节pH至5～6，有大量絮状沉淀生成，将溶液浓缩至30mL，得到粗品，乙醇重结晶得到黄色固体1（2.12g）.产率61%.m.p.232.1～234.6℃；1H NMR（400MHz，DMSO）δ：9.82（s，1H），7.23（d，J＝8.4Hz，1H），6.67（dt，J＝8.1，2.2Hz，3H），5.24（s，2H）.

1.3 2-（3-（4-二乙氨基-2-羟基）苯甲醛）-7-羟基-香豆素的合成

将3-氨基-7-羟基香豆素1（1.77g，10.0mmol），4-二乙氨基水杨醛（1.93g，10.0mmol）和冰醋酸（0.1 mL）加入无水乙醇（60mL）中，在N2保护下，加热回流反应12h，冷却有大量黄棕色固体生成，沉淀经过滤，水洗，干燥，用无水乙醇重结晶得到2.产率87%.m.p.151.5～151.7℃；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：13.54（s，1H），8.90（s，1H），7.83（s，1H），7.46（d，J＝8.6Hz，1H），7.27（d，J＝8.9Hz，1H），6.75（dd，J＝8.5，1.8Hz，1H），6.67（s，1H），6.31（dd，J＝8.9，2.2Hz，1H），6.05（d，J＝2.1Hz，1H），3.58（s，1H），3.41～3.36（m，4H），1.11（t，J＝7.0Hz，6H）.13C NMR（100MHz，DMSO）：δ：163.6，162.2，161.5，158.6，153.5，151.9，134.1，129.1，128.9，128.5，114.3，111.1，108.8，104.1，102.1，96.8，44.1，12.6.ESI-HRMS（m/z）：Calcd.For C20H20N2O4（［M＋H］＋）：353.149 6；Found：353.149 5.

1.4 （3-（4-二乙氨基-2-羟基）苯甲醛）-7-甲氧基-香豆素的合成

将化合物2（281mg，1.0mmol）、碳酸钾（250mg）加入无水丙酮（10mL）中，在0℃条件下，将碘甲烷（200mg，1.4mmol）缓慢加入反应溶液中，TLC跟踪反应，回流反应10h，趁热将反应液抽滤，滤饼用丙酮冲洗，合并滤液，将滤液旋干，用乙酸乙酯（50mL）萃取，有机层经干燥、旋干、柱层析分离［V（石油醚）∶V（丙酮）＝3∶1］后得黄色固体3（296mg）.产率81%.m.p.193.8～196.2℃.1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：13.56（s，1H），9.19（s，1H），7.50（s，1H），7.39（d，J＝8.5Hz，1H），7.18（d，J＝8.8Hz，1H），6.86（dt，J＝7.0，2.4Hz，2H），6.25（dd，J＝8.8，2.5Hz，1H），6.16（d，J＝2.4Hz，1H），3.87（s，3H），3.40（q，J＝7.1Hz，4H），1.21（t，J＝7.1Hz，6H）.13C NMR（100MHz，CDCl3）δ：164.1，163.6，161.9，158.8，153.4，152.2，134.6，131.2，129.9，128.5，113.7，113.0，109.4，104.2，100.5，97.7，55.9，44.7，12.8.ESI-HRMS（m/z）：Calcd.For C21H22N2O4（［M＋H］＋）：367.165 2；Found：367.165 8.

2 结果与讨论

2.1 化合物的结构确认

目标化合物3的NMR信号中出现δ13.56峰，该质子峰应归属于分子内的氢键信号，这是由于其结构中存在邻羟基亚胺，容易形成分子内氢键.与此类似，化合物2也出现同样现象，其分子内氢键的质子信号为δ 13.54.同时，化合物2中存在的另一个酚羟基（香豆素母核）属于孤立的酚羟基，其质子信号出现在δ3.5～3.7，为一宽峰.两个化合物中的其余质子信号均与其结构一一对应.

2.2 探针对不同金属离子的选择性

为了考察目标化合物对不同金属离子的选择性，采用荧光光谱法测试了常见金属离子对探针3的荧光光谱的影响（见图2）.探针3具有较强的荧光发射性质，在440nm波长激发下，在524nm处出现较强的荧光发射峰.当向探针3的溶液（10μmol/L）中分别加入100μmol/L的Fe3＋、Mn2＋、Ag＋、Cr3＋、Cd2＋、Pb2＋、Hg2＋、Ca2＋等金属离子后，524nm处的荧光几乎不变，表明化合物3与这些离子没有相互作用.

当向探针3的溶液中分别加入Co2＋，Fe2＋时，体系的荧光强度明显降低，表明Co2＋，Fe2＋与目标化合物存在一定程度的相互作用.值得注意的是，当加入Cu2＋时，探针3的荧光几乎完全猝灭.上述结果表明探针3对Cu2＋具有显著的选择性.香豆素是一种经典的荧光发射团，特别是其7-位和3-位取代基的电子“推-拉”作用，能够影响香豆素的分子内电荷转移（ICT）过程，进而改变其荧光发射性质.化合物3在香豆素3-位上引入3邻羟基亚胺，有助于香豆素的ICT过程，因而显示出较强的荧光发射光谱.同时，由于邻羟基亚胺结构提供了合适的配体环境，能够与铜离子发生配位，而Cu2＋自身具有顺磁性，往往导致体系的荧光猝灭（图3）［18］.实验结果表明，Cu2＋能与化合物3发生配位作用，阻碍化合物的ICT过程，导致荧光猝灭.

图2 探针3溶液（10μmol/L）中加入不同金属离子时的荧光发射光谱Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe 3 solution（10μmol/L）upon addition of various metal ions

图3 荧光猝灭机制Fig.3 The proposed mechanism of fluorescence quenching

2.3 探针对铜离子的响应性质

利用荧光滴定实验考察探针对铜离子的响应性质.如图4所示，在HEPES buffer（0.1mol/L，pH＝7.4，质量分数为0.2%的CH3CN）中，加入不同浓度的Cu2＋，测试探针3（10μmol/L）的荧光光谱.结果显示，随着Cu2＋加入量的增加，探针3的荧光发射强度逐渐降低.当加入等物质的量的Cu2＋时，探针3在524 nm处的荧光完全猝灭，且荧光强度与Cu2＋浓度在0.66～10μmol/L范围内呈良好的线性关系，最低检出限可达0.8μmol/L.Job分析法表明化合物3与金属离子以1∶1比例结合形成络合物（见图5）.

图4 探针3（10μmol/L）在HEPES缓冲溶液中加入不同浓度Cu2＋的荧光变化Fig.4 Emission spectra of 3（10μmol/L）in HEPES buffer upon addition of various concentrations of Cu2＋

图5 探针3与Cu2＋络合的Job-plot图Fig.5 The Job-plot of probe binding to Cu2＋

3 结论

基于香豆素母核结构，设计、合成了具有Cu2＋高选择性识别的香豆素类荧光分子探针.该探针对Cu2＋有较好的选择性和灵敏度，检出限达到0.8μmol/L；并且在0.66～10μmol/L范围内，探针的荧光强度与其浓度有良好的线性关系，可以定量检测该范围内的Cu2＋.本文为有机及生物环境中的Cu2＋识别检测提供了一种有效的分子荧光探针.

［1］DAVIS A V，O′HALLORAN T V.A place for thioether chemistry in cellular copper ion recognition and trafficking［J］.Nat Chem Biol，2008，4：148-151.

［2］THIELE D J，GITLIN J D.Assembling the pieces［J］.Nat Chem Biol，2008，4：145-147.

［3］ROBISON N J，WINGE D R.Copper metallochaperones［J］.Annu Rev Biochem，2010，79：537-562.

［4］HARRIS E D.Basic and clinical aspects of copper［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2003，40：547-586.

［5］BRITTON R S.Metal-induced hepatotoxicity［J］.Semin Liver Dis，1996，16：3-12.

［6］COOPER G J S.Selective divalent copper chelation for the treatment of diabetes mellitus［J］.Curr Med Chem，2012，19：2828-2860.

［7］GHAEMIAN A，SALEHFAR E，JALALIAN R，et al.Zinc and copper levels in severe heart failure and the effects of atrial fibrillation on tne zinc and copper status［J］.Biol Trace Elem Res，2011，143：1239-1246.

［8］HADI S M，ULLAH M F，AZMI A S，et al.Resveratrol mobilizes endogenous copper in human peripheral lymphocytes leading to oxidative DNA breakage：A putative mechanism foe chemoprevention of cancer［J］.Pharm Res，2010，27：979-988.

［9］KALER S G.ATP-related copper transport disease-emerging concepts and future trends［J］.Nat Rev Neurol，2011，7：15-29.

［10］DU Jianjun，HU Mingming，FAN Jiangli，et al.Fluorescent chemodosimeters using“mild”chemical events for the detection of small anions and cations in biological and environmental media［J］.Chem Soc Rev，2012，41：4511-4535.

［11］WU Jiasheng，LIU Weimin，GE Jiechao，et al.New sensing mechanisms for design of fluorescent chemosensors emerging in recent years［J］.Chem Soc Rev，2011，40：3483-3495.

［12］陈稼轩，田 怡，向清祥，等.罗丹明B衍生物的合成及其对Cu2＋，Hg2＋的识别研究［J］.有机化学，2012，32：1930-1935.

［13］李 娜，刘美玲，尹文婷，等.罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针研究的一些新进展［J］.有机化学，2011，31：39-53.

［14］黄文君，吴文辉，梁嘉香.基于脱硫反应的硫脲基罗丹明B汞离子荧光化学剂量计的合成及分子氢键的影响［J］.化学学报，2012，70：873-880.

［15］YUAN Lin，LIN Weiying，CAO Zengmei，et al.Photocontrollable analyte-responsive fluorescent probes：A photocaged copper-responsive fluorescence turn-on probe［J］.Chem Eur J，2011，17（2）：689-696.

［16］YU Chunwei，CHEN Lingxin，ZHANG Jun，et al.“Off-On”based fluorescence chemosensor for Cu2＋in aqueous media and living cells［J］.Talanta，2011，85（3）：1627-1633.

［17］LIU Zhipeng，ZHANG Changli，WANG Xiaoqing，et al.Design and synthesis of a ratiometric fluorescent chemosensor for Cu（II）with a fluorophore hybridization approach［J］.Org Lett，2012，14：4378-4381.

［18］SHI Yonggang，YAO Jianhua，DUAN Yulian，et al.1，8-Naphthalimide-Cu（II）ensemble based turn-on fluorescent probe for the detection of thiols in organic aqueous media［J］.Bioorg Med Chem Lett，2013，23：2538-2542.