郑燕林 刘聪慧 沙菽

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一个Zn+依赖性蛋白酶家族，产生于正常组织细胞(包括结缔组织细胞、内皮细胞、胸腺细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等)和肿瘤细胞，以前酶形式分泌，于细胞外间隙激活后发挥作用。

研究已发现MMPs与血管新生［1-3］、肿瘤细胞的侵袭及转移以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解过程密切相关，是降解ECM的主要成份［4-7］。前期研究发现64 g·L－1水蛭提取液对体外培养的视网膜血管内皮细胞有抑制增殖作用［8］，为进一步证明水蛭提取液对内皮细胞微环境的作用，本实验拟采用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent，ELISA)、放射免疫法检测水蛭提取液对细胞培养上清液中 MMP-2、IV型胶原(IV型胶原)表达的影响，初探水蛭提取液对新生血管生长的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 中药水蛭提取液购自成都中医药大学附属医院制剂科(批号:2007030201)，RF/6A(上海中科院细胞库)，体积分数为10%的特级胎牛血清(北京元亨公司)，1640干粉(GIBCO公司)，25 g·L－1胰蛋白酶(美国 Sigma公司)，MCD-15A 型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)，JJT-900/1300型超净工作台(北京半导体设备厂)，XDS-1型倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)，IV型胶原放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)，MMP-2 ELISA试剂盒(上海森雄公司)，GC-1200放射免疫技术器(中国科大创新股份有限公司)，550酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 水蛭提取液的制备 取水蛭粗粉31.5 g，加体积分数75%乙醇200 mL，使均匀润湿，加盖，放置2 h，装入渗滤筒中。添加体积分数75%乙醇高出药面3 cm，排除筒内空气。加盖放置48 h后放出药液，流速3 mL·min－1，并从药面不断添加体积分数75%乙醇5000 mL，渗滤液回收乙醇至无醇味，定容至50 mL，每毫升相当于0.63 g原生药，药液经60℃照射灭菌，备用。……