黄毅 袁小红 刘卓

摘要 [目的]建立测定断血流中的香蜂草苷含量的方法，考察不同产地断血流中香蜂草苷的含量。[方法]采用Zorbax Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），柱温25 ℃，流动相为甲醇-水（48∶52），流速0.8 ml/min，检测波长285 nm。建立了高效液相色谱法测定断血流中香蜂草苷的含量。[结果]香蜂草苷在20.84～104.20 μg/ml的范围内线性关系良好（r=0.999 4），平均加样回收率（n=9）为98.63%（RSD=2.57%）。[结论]所建方法快捷简便、准确、重复性好，可作为断血流中香蜂草苷含量检测的方法。

关键词 断血流；香蜂草苷；含量；高效液相色谱法

中图分类号 S567 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）31-10907-02

HPLC Determination of Didymin in Duanxueliu Herb

HUANG Yi1，2，YUAN Xiaohong1，LIU Zhuo1 （1.School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010； 2.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065）

Abstract [Objective] To establish a method by DADHPLC for determining the content of didymin in Duanxueliu herb from different habitats.[Method] Zorbax Eclipse XDB C18 chromatographic column（4.6 mm×150 mm，5.0 μm） and methanolwater（48∶52） as mobile phase were comployed，at a flow rate of 0.8 ml/min，a detecting wavelength at 285 nm.[Result] The standard curve of didymin was linear in the range of 20.84-104.2 μg/ml（r=0.999 4）.The average recovery of didymin was 98.63% with the RSD of 2.57% （n=9）.[Conclusion] This method is rapid，simple，sensitive，reliable，accurate and suitable for the analysis and determination of didymin in Duanxueliu herb.

Key words Duanxueliu herb； Didymin； Content； HPLC

斷血流为唇形科植物荫风轮Clinopodium polycephalum （Vaniot）C.Y.Wu et Hsuan 或风轮菜Clinopodium chinensis（Benth.）O.Kuntze 的干燥地上部分，具有收敛止血之功效，主要用于治疗崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血、创伤出血等出血症及单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等症^[1]。中国药典2010版一部中将醉鱼草皂苷IVb作为其主要活性成分进行鉴别检测^[2]。除醉鱼草皂苷外，断血流中还含有多种活性成分，主要是黄酮及其苷、三萜及其苷类以及环烯醚萜苷类等。近年来，其中的黄酮苷——香蜂草苷开始引起大家的研究热情。香蜂草苷最早由Wagner等于1967年在同科美国薄荷属（Monarda）植物美国薄荷（Monarda didyma）的叶中发现^[3]，戴金瑞在1983年首次从风轮菜中分离并鉴定该化合物^[4]，陈靖宇等1997年首次从荫风轮中分离并鉴定该化合物（图1）^[5]。最新的药理研究发现香蜂草苷可通过抑制癌基因 N-Myc 以及上调Raf激酶抑制蛋白（RKIP）诱导神经母细胞瘤细胞凋亡^[6]，使其可能成为一个非常有潜力的治疗神经细胞瘤的先导化合物。同时，该化合物也显示出了对非小细胞肺癌有一定的治疗效果^[7]。作为一个有开发潜力的候选化合物，目前尚无其含量测定方法。该研究采用反相高效液相色谱法对断血流中香蜂草苷进行含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器 美国 Agilent 1260型高效液相色谱仪：包括DAD检测器、四元梯度泵、在线真空脱气机、安捷伦化学工作站；赛多利斯Acculab Alc电子天平；KS120E超声波清洗机；上海亚荣RE201D旋蒸蒸发仪等。

1.2 试药 香蜂草苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，HPLC检测为单峰，采用归一化法计算其纯度>98%）；断血流药材于2012年5月购自湖北和安徽金寨；甲醇为色谱纯（美国FISHER公司），超纯水由实验室自制，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置。

1.3.1.1 对照品溶液的制备。精密称取香蜂草苷对照品5.21 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解、定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液，冰箱4 ℃保存备用。

1.3.1.2 供试品溶液的制备。精密称取断血流药材粗粉5 g，置于圆底烧瓶中，加入300 ml 80%乙醇，80 ℃回流提取3 h，抽滤后，旋干溶液，用甲醇定容至20 ml容量瓶中，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

1.3.2 色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇-水（48∶52），流速0.8 ml/min，柱温25 ℃；利用DAD检测器在190～400 nm对对照品进行波长扫描，确定样品测定的最大吸收峰位置。

1.3.3 标准曲线的绘制。对照品溶液按比例配制为6个浓度（20.84、41.68、52.10、62.52、83.36、104.20 μg/ml），按照“1.3.2”色谱条件测定，每次进样5 μl，以对照品浓度为横坐标、色谱峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 精密度试验。精密称取“1.3.1.1”制备的对照品溶液5 μl，重复进样6次，测得各次峰面积，计算RSD值，要求该值小于3%。

1.3.5 重复性试验。精密称取6份同批断血流药材，按照“1.3.1.2”项的方法平行制备供试品溶液6份，测定各份药材中香蜂草苷的含量，并计算RSD，要求该值小于3%。

1.3.6 稳定性试验。取重复性试验中6份样品，放置0、2、4、8、10、12 h后，各精密进样5 μl，测定测定香蜂草苷的峰面积并计算RSD值。

1.3.7 加样回收率试验。分别精密吸取对照品溶液（另配，429 μg/ml）3.0、3.5、4.0 ml各3份，加入到500 mg原药材粉末中，照“1.3.1.2”方法操作，测得香蜂草苷含量，计算加样回收率和RSD。

1.3.8 样品含量测定。取不同产地的断血流药材，按照“1.3.1.2”项的方法制备供试品溶液，按照“1.3.2”项的色谱条件，测得两地药材中香蜂草苷的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及系统适应性试验 由对照品在190～400 nm的波长扫描结果（图2）可见，香蜂草苷在190、215、228和285 nm处有较大紫外吸收，鉴于有机化合物在232 nm以下干扰重的原因，在此选定最佳检测波长为285 nm。在该检测波长及相应色谱条件下，绘制对照品及供试样品色谱图（图3）。由图3可见，对照品及供试品溶液中的香蜂草苷保留时间均为9.3 min，样品所测定主峰旁边无明显杂峰，经计算样品与其他组分峰的分离度>1.5，理论塔板数按香蜂草苷计均不低于4 000，符合药典测定要求。

2.2 标准曲线的绘制 通过以上色谱条件定量

测定对照品，绘制标准曲线，数据经过回归处理，得香蜂草苷的回归

方程为Y=3.385x+0.154（r=0.999 4），表明香蜂草苷在浓度20.84～104.20 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3 精密度试验 重复进样6次，定量测定含量，计算RSD值为1.23%，表明精密度良好，符合含量測定要求。

2.4 重复性试验 平行样6份，定量测定含量，其平均含量为64 μg/ml，RSD值为1.02%，表明用此方法测定香蜂草苷含量，重现性良好。

2.5 稳定性试验 取重复性试验中6份样品，放置0、2、4、8、10、12 h后，各精密进样5 μl，测定香蜂草苷的峰面积，计算RSD值为1.3%，表明供试品溶液在12 h基本稳定。

2.6 加样回收率试验 由表1可见，香蜂草苷的平均加样回收率为98.63%，RSD<2.57%，表明该方法回收率较好，方法可行。

3 讨论

目前，断血流的主要研究热点还在其三萜皂苷类成分，药典中也选择醉鱼草皂苷IVb作为指标成分对断血流药材的质量进行考察，并且也只是采用薄层色谱进行定性鉴定，无含量测定方法。部分文献研究了以醉鱼草皂苷IVb^[8-10]以及主要止血活性成分风轮菜皂苷A^[11-13]作为质控指标的检测方法。鉴于其黄酮苷可能成为未来抗癌药物研究的热点靶标，笔者首次采用高效液相色谱法测定了断血流中香蜂草苷的含量，试验结果表明，该含量测定方法简便、灵敏、重现性好，可推广使用。

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