杨佃会，马祖彬，韩 晶，陈新勇

(1.山东中医药大学，济南250355;2.山东中医药大学附属医院，济南250011;3.单秋华全国名老中医药专家传承工作室，济南250011)

耳缘静脉放血对偏头痛家兔模型的镇痛效应及中脑导水管周围灰质c-fos表达的影响

杨佃会1，2，3，马祖彬2，3，韩 晶2，3，陈新勇2，3

(1.山东中医药大学，济南250355;2.山东中医药大学附属医院，济南250011;3.单秋华全国名老中医药专家传承工作室，济南250011)

目的 观察耳缘静脉放血对偏头痛家兔模型的镇痛效应及对中脑导水管周围灰质(PAG)c-fos的表达，从而揭示耳缘静脉放血的镇痛作用机制。方法 30只新西兰家兔按随机数字表分为耳缘静脉放血组、模型组和空白组。按5 mg/kg标准连续3 d颈后皮下注射硝酸甘油复制偏头痛家兔模型，在第3天造模60 min后耳缘静脉放血，分别在造模前、造模30 min和放血后即刻进行痛阈测定。免疫组化法观察偏头痛家兔模型PAG区c-fos表达。结果 痛阈改变:造模30 min耳缘静脉放血组和模型组的痛阈明显降低，与造模前比较有统计学意义(P＜0.01)，与空白组比较均有统计学意义(P＜0.01);耳缘静脉放血组放血后即刻痛阈明显升高，与造模30 min比较有统计学意义(P＜0.01)，与模型组比较有统计学意义(P＜0.05);耳缘静脉放血组家兔模型PAG区c-fos阳性细胞数明显降低，与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)。结论 耳缘静脉放血有明显的镇痛作用，通过抑制偏头痛家兔模型PAG区c-fos基因表达发挥了镇痛效应。

耳缘静脉放血;偏头痛;家兔模型;c-fos;痛阈测定

笔者既往临床观察耳穴综合疗法治疗偏头痛疗效显著［1］，并对外周神经递质的作用机制也进行了初步探讨［2-4］。耳背静脉放血为关键技术，能够明显降低中脑导水管周围灰质PAG区G蛋白含量［5］，而对PAG区c-fos蛋白的影响尚不清楚，探讨对PAG区c-fos蛋白的表达进一步揭示耳缘静脉放血的中枢镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 材料 1)实验动物:健康纯种新西兰家兔30只，体质量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由济南西岭角养殖繁育中心提供，生产许可证号:SCXK(鲁)20090013。将30只纯种新西兰家兔按随机数字表法分为耳缘静脉放血组、模型组和空白组，每组10只，雌雄各半。2)主要试剂和仪器:硝酸甘油注射液(5 mg/1 mL，北京益民药业有限公司，批号20111202)，c-fosAntibody(S-045-50，0.05 mg，购自济南美斯泰商贸发展有限公司，Novus生产)，免疫组化染色试剂盒(PV-9003，北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB试剂盒(ZLI-9018，北京中杉金桥生物技术有限公司)。组织脱水机(ASP300S，LEICA)，石蜡包埋机(EG1150H，LEICA)，生物组织摊烤片机(YT-7FB，亚光医用电子技术有限公司)，显微镜(BX51，OLYMPUS)，丹吉尔数字医学图像分析系统(DEIAS-2000P/C/E/U，济南丹吉尔电子有限公司)，WQ-9E测痛仪(北京海淀区电子仪器厂生产)。

1.2 模型制备 参照经典硝酸甘油造模法，按5 mg/kg标准颈后皮下注射硝酸甘油造模。造模1次/d，分别在第3天造模前、造模30、60 min后进行痛阈测定。痛阈测定法:采用钾离子透入法。安静环境中，将家兔固定在固定器中，先用脱毛剂脱去两侧耳朵毛，在家兔一侧耳表面安装含有饱和氯化钾溶液的电极，无关电极接在另一侧耳，两个电极与QW-9E测痛仪相连，用电流强度线型递增的直流电将K+导入皮肤做痛刺激。选用阶梯输出，电流强度0～10 mA，阶宽1 s，阶高0.1 mA。以家兔头部开始出现挣扎反应作为疼痛指标，经引起家兔挣扎反应的最小电流强度作为痛阈，共测3次，每次间隔5 min，取其平均值作为痛阈。

1.3 治疗方法 耳缘静脉放血组第3天造模30 min后耳缘静脉放血1次。用75%的乙醇棉球在耳缘静脉处进行局部消毒，实验者以一手固定住家兔的耳朵，另一手持一次性注射针头于耳缘静脉远心端快速点刺使之出血，双侧耳缘静脉可出血约2～3 mL。放血后30 min进行痛阈测定。

1.4 标本处理 用戊巴比妥钠按30 mg/kg标准耳缘静脉注射麻醉，麻醉成功后，仰卧固定，开胸，左心室插管，剪开右心耳，先迅速灌注生理盐水，至家兔肝脏及肠系膜变苍白后，再灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液500 mL，以固定标本。灌注结束后，打开颅腔将全脑取出，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中后固定，并标号。参照Sawyer氏图谱定位，切取中脑导水管周围灰质区脱水、包蜡。对PAG区作连续冠状切片，每张片厚3 μm，脑切片每隔5张留取一张，共选取5张切片。

1.5 免疫组织化学染色 3%H2O2去离子水孵育10 min;蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min×3次;滴加1∶150稀释的一抗，37℃孵育1 h;PBS冲洗，3 min×3次;滴加试剂1，37℃孵育20 min;PBS冲洗，3 min×3次;滴加试剂2，37℃孵育20 min;PBS冲洗，3 min×3次。将玻片甩干后，滴加DAB显色剂，显色2 min。自来水充分冲洗。复染，脱水，透明，封片。阴性对照组以PBS代替一抗。

1.6 图像分析 c-fos免疫组化染色，镜下可见背景为米白色，c-fos免疫反应阳性神经元呈黄褐色，以核染为主。光镜下观察每张切片的中央、左上、左下、右上、右下5个高倍视野的阳性细胞数之和。

1.7 统计学分析 所有数据输入计算机用SPSS 17.0 for windows软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，组间比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 3组偏头痛家兔模型痛阈改变情况比较 见表1。

表1 3组偏头痛家兔模型痛阈改变情况比较(±s，n=10)mA

表1 3组偏头痛家兔模型痛阈改变情况比较(±s，n=10)mA

注:与造模前比较，##P＜0.01;与造模 30 min比较，△△P＜0.01;与空白组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与模型组比较，★P＜0.05

组 别 造模前 造模后30 min 造模后60 min空白组 7.82±1.35 7.42±1.76 7.47±1.39模型组 8.11±0.75 4.29±1.09##▲▲3.66±1.12▲▲耳缘静脉放血组 7.91±1.49 4.06±1.05##▲▲5.92±1.65△△▲★

2.2 3组偏头痛家兔模型PAG区c-fos阳性细胞数比较 见表2。

表2 3组偏头痛家兔模型PAG区c-fos阳性细胞数比较(±s，n=10)

表2 3组偏头痛家兔模型PAG区c-fos阳性细胞数比较(±s，n=10)

注:与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 c-fos 阳性细胞数空白组 61.70±13.99模型组 301.40±33.43##耳缘静脉放血组 155.20±27.66#△△

3 讨论

耳穴治疗偏头痛历史悠久，早在《灵枢·厥病》中有耳背放血治疗头痛的记载:“头痛甚，耳前后动脉涌有热，泻出其血。”《灵枢·口问》曰:“耳者，宗脉之所聚也。”说明经络与耳有十分密切的联系。偏头痛发病日久，瘀血阻络是一个重要证型［6］，活血化瘀为内治大法［7-8］，而采用耳背静脉放血法切中病机。同时现代医学也证实了耳廓有来自诸如耳大神经、枕小神经、耳颞神经、面神经、舌咽神经、迷走神经的分支及交感神经等。刺激耳廓某些特定部位，可以促进脑组织乳酸堆积的清除、抑制自由基反应，从而调节脑内兴奋性氨基酸递质代谢，减轻神经元细胞损伤的作用［9］，通过神经体液途径，调节机体内分泌系统、免疫系统［10］，起到通调气血，祛邪止痛作用［11］。

近年来发现c-fos基因参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程。硝酸甘油模型引起三叉神经纤维的超敏性，引发头痛，可引起c-fos在三叉神经脊束背核尾侧亚核(TNC)内相似区域的快速表达［12-16］。有研究［17］表明鼻疗法喷雾剂能治疗偏头痛的作用机制是控制中脑导水管周围灰质c-fos蛋白的表达。本研究结果耳缘静脉放血能明显升高偏头痛家兔模型的痛阈(P＜0.01)，与模型组比较有统计学意义(P＜0.05)，说明耳缘静脉放血能明显升高偏头痛家兔模型痛阈，起到明显的镇痛效应，其作用机制是通过抑制PAG区c-fos基因的异常表达来参与镇痛效应。

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［1］杨佃会，马祖彬，韩晶，等.耳穴综合疗法治疗无先兆型偏头痛:多中心对照观察［J］.中国针灸，2012，32(11):971-974.

［2］杨佃会.耳综疗法对无先兆偏头痛患者血浆5-HT，SP，β-EP影响的研究［J］.山东中医药大学学报，2008，32(9):389-391.

［3］杨佃会.耳穴综合疗法对不同时期无先兆偏头痛患者血浆P 物质的影响［J］.中国针灸，2009，29(3):189-191.

［4］杨佃会，马祖彬，韩晶，等.自血穴注阳陵泉对偏头痛模型大鼠血浆5-羟色胺、β-内啡肽和 P物质的影响［J］.长春中医药大学学报，2013，29(5):768-769.

［5］杨佃会，阚俊祯，马祖彬，等.耳缘静脉放血对偏头痛家兔模型PAG区G蛋白的影响［J］.山东中医药大学学报，2014，38(1):56-57，61.

［6］张萍，顾锡镇.正天丸治疗瘀血阻络型偏头痛临床药效研究［J］.吉林中医药，2012，32(9):875-876.

［7］李方，全亚萍，陈园桃.偏头痛中医内治法辑要［J］.吉林中医药，2012，32(1):40-42.

［8］王玮，全亚萍，陈园桃.偏头痛与相关性疾病中西医机制探讨［J］.长春中医药大学学报，2013，29(2):262-263.

［9］张雪朝，吕明庄，蒋乃昌，等.耳针对血管性痴呆大鼠记忆及海马凋亡相关蛋白表达的影响［J］.中国针灸，2001，21(8):52-53.

［10］刘智艳，姚小红.耳针疗法作用机理研究进展［J］.针灸临床杂志，2005，21(4):62-63.

［11］韦淑娅.电针结合穴位埋线治疗偏头痛临床观察［J］.吉林中医药，2013，33(3):295-296.

［12］Tassorelli C，Greco R，Cappelletti D，et al.Comparative analysis of the neuronal activation and cardiovascular effects of nitroglycerin，sodium nitroprusside and L-arginine［J］.Brain research，2005，1051(1):17-24.

［13］刘若卓，于生元，王贺波，等.刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜对中脑导水管周围灰质c-fos蛋白表达的影响［J］.中国康复医学杂志，2003，18(1):10-13.

［14］张红岩，于挺敏.中脑导水管周围灰质与偏头痛［J］.中风与神经疾病杂志，2008，25(2):253-254.

［15］郭琳，洪治平.硝酸甘油型实验性偏头痛模型原理与研究现状［J］.中国疼痛医学杂志，2004，10(6):357-359，364.

［16］赵永烈，王爱成，陈锦锋，等.硝酸甘油型偏头痛模型评述［J］.中国康复理论与实践，2005，11(6):455-456.

［17］杨德功，黄厚才，刘红权，等.鼻疗法喷剂治疗偏头痛在中脑导水管周围灰质c-fos蛋白的表达［J］.中国现代药物应用，2008，2(7):33-34.

C-fos expression in PAG area of ear-edge vein bloodletting on rabbit models of migraine

YANG Dianhui1，2，3，MA Zubin2，3，HAN Jing2，3，CHEN Xinyong2，3
(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China;3.Famous Traditional Chinese Medical Doctor Shan Qiuhua's Inheritance Studio，Jinan 250011，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the analgesic effect of ear-edge vein bloodletting on rabbit and the influence of c-fos expression in the periaqueductal gray(PAG)area.Consequently，reveal the analgesic mechanism of marginal vein bloodletting ears.Methods30 New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups，ear-edge vein bloodletting group，model group and blank group.By subcutaneous injection nitroglycerin in the rabbits'neck according to the standard of 5 mg/kg for 3 day，the migraine models were successfully copied.The ear-edge vein blood were ensanguined after 60 minutes of molding，pain threshold was determined in front of the building，building immediately after 30 min and bleed.Then we observed the expression of c-fos in PAG of rabbits by immunohistochemical method after the end of the course.ResultsThe change of pain threshold:the pain threshold of ear-edge vein bloodletting group and model group were significantly reduced，compared with before building has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with blank group has a very significant difference(P ＜0.01);the immediate pain threshold of ear-edge vein bloodletting group was increased significantly，compared with after 30 minutes of molding has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with model group has a very significant difference(P ＜0.01);positive cells in the PAG area c-fos of ear-edge vein bloodletting group were significantly decreased，compared with model group(P ＜0.01).ConclusionThe therapy of ear-edge vein bloodletting has analgesic effect，which can decrease the expression of c-fos gene in PAG of rabbit models of migraine.

Key words:ear-edge vein bloodletting;migraine;rabbit model;c-fos;pain threshold determination

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0576－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.005

山东省自然科学基金资助项目“耳缘静脉放血对偏头痛家兔模型镇痛调控机制的研究”(ZR2009CM058)。

杨佃会(1966－)，男，医学博士，教授，博士研究生导师。研究方向:耳穴综合疗法治疗偏头痛。

(

2014－04－02)