宋飞，向盈盈，张小文Δ

（1.昆明医科大学第二附属医院 肝胆胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安医院 口腔科，云南 昆明 650031）

紫杉醇抗良性胆管瘢痕纤维化的最佳抵抗因素研究

宋飞1，向盈盈2，张小文1Δ

（1.昆明医科大学第二附属医院 肝胆胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安医院 口腔科，云南 昆明 650031）

目的探讨紫杉醇（paclitaxel，PTX）抗良性胆管瘢痕纤维化的最佳抵抗因素，为临床防治胆管良性瘢痕纤维化提供有效依据。方法体外培养人胆管上皮细胞（biliary epithelial cell，BEC），并将配制好的PTX药物浓度梯度按0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM加入细胞培养板培养48 h，MTT法检测PTX对BEC半抑制率IC50，从而确定最佳PTX浓度；人胆管上皮细胞培养0 h，24 h，48 h，72 h，MTT法测 100 nM、250 nM、500 nM 3种不同含量的紫杉醇-壳聚糖缓释膜（PTX-Chitosan Sustained release membrane，PTX-SRM）与最佳浓度PTX对BEC的抑制率，得到最佳浓度的PTX-SRM；细胞培养48 h，72 h后采用Western Blot和Realtime PCR方法检测PTX及PTX-SRM对BECα-SMA、E-cadherin、Vimentin蛋白及基因表达变化。结果单独PTX对良性胆管瘢痕发挥抵抗作用的最佳浓度为250 nM；PTX和PTX-SRM均能有效抑制BEC的增殖、转化；中、低浓度的PTX-SRM对良性胆管瘢痕纤维化的治疗效果最佳，最佳载药量分别为100 nM、250 nM；PTX-SRM对BEC的抑制持续时间长于单独PTX（P＜0.05）。结论PTX－SRM对BEC增殖、转化的抑制作用优于单独PTX给药，为临床对良性胆管瘢痕的预防和治疗提供了科学可行的新方法。

紫杉醇；良性瘢痕纤维化；抵抗；壳寡糖缓释膜

1 材料与方法

1.1 材料 人胆管上皮细胞（ScienCell公司，货号：5100），紫杉醇（重庆美联制药有限公司，货号：G0411003）、PRIM 1640培养基（Hyclone公司，货号：11875-093），胰酶-EDTA消化液（Gibco公司，货号：25200-056，），二甲基亚砜（sigma公司，货号：D-2650），噻唑蓝（美国 Sigma公司，货号：0793），胎牛血清（Gibco公司，货号：10099141），TGF-β1（美国 PeproTech公司，货号：100-21c），ZW-A型微量振荡器（金坛市白塔新宝仪器厂）。PT-3502酶标分析仪（北京普天新桥技术有限公司），MCO-15AC二氧化碳培养箱（上海旦鼎国际有限公司），H1650-w型微量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），紫杉醇分别配制浓度为0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM的溶液，体积均为20mL。

3种不同浓度的紫杉醇-N-琥珀酰化羟乙基壳聚糖缓释膜为本实验室前期自制合成，紫杉醇载药量分别为100 nM、250 nM、500 nM。

1.2 实验分组

1.2.1 体外培养BEC，加sns／m L TGF-b1诱导形成胆管瘢痕，根据不同处理分为A、B、C、D、E共5组，其中A组为未载药SRM组；B组为最佳PTX浓度组；C组为100 nM PTX-SRM组；D组为250 nM PTX-SRM组；E组为500 nM PTX-SRM组。

1.2.2 试验分为6组：①对照组为单独BEC培养；②TGF-β1组为 BEC＋5 ng／mL TGF-β1；③TGF-β1＋PTX（48 h）组为在48小时时间点下，BEC＋5 ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX；④TGF-β1＋PTX（72 h）组为在 72小时时间点下，BEC＋5 ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX；⑤TGF-β1＋SRM（48 h）组为在48小时时间点下，BEC＋5 ng／m L TGF-β1＋250 nM PTX-SRM；⑥TGF-β1＋SRM（72 h）组为在72小时时间点下，BEC＋5ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX-SRM。

1.3 实验步骤

1.3.1 MTT法测定细胞生长抑制率，确定IC50：将处于对数生长期的BEC用0.25%的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×104个／mL并接种于96孔板，每孔50μL。接种细胞分别为空白组（不含细胞的培养液）、细胞对照组（含单细胞的培养液）、紫杉醇药物实验组（浓度梯度为0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM）。每排12个孔，边缘孔用 Hank液填充。紫杉醇原浓度配制为50 uM。孵箱常规培养48 h。培养结束时加入5mg／mL的噻唑蓝20μL，继续孵育4 h后离心弃上清，加入DMSO 150μL，90 rpm摇床上振荡5min。在酶标仪上测定490 nm的吸光度值（A值），计算公式：抑制率＝1-（实验组A值一空白组A值）／（对照组A值一空白组A值）。确定紫杉醇溶液抑制一半胆管上皮细胞生长时的浓度（IC50），选择最佳紫杉醇的浓度。

1.3.2 在PTX最佳抑制浓度的前提下，按照1.2.1实验分组，在0小时，24小时，48小时，72小时时间点下用MTT法测定PTX-SRM及PTX对BEC生长的增殖的影响。增殖率＝（实验组A值一空白组A值）／（对照组A值一空白组A值）（MTT方法同3.1.1）。PTX-SRM裁剪大小为0.25 cm2放入具有PTX-SRM实验组培养板中。确定PTX-SRM的最佳载药量。

1.3.3 按照1.2.2实验分组，Real-time PCR方法检测胆管上皮细胞α-SMA、E-cadherin、Vimentin mRNA表达：收集 PTX及PTX-SRM预处理48，72 h的胆管上皮细胞，PBS洗涤2次，细胞计数板计数，取同等量细胞，TRizol试剂盒抽取细胞总 mRNA。2μLmRNA，总体系为20μL逆转录合成 cDNA。PCR反应体系为 25μL：2.5μL 10×Buffer，1.5μL 25 mmol／L MgCl2，0.5μL dNTP，0.5μLcDNA，各 0.5μL上下游引物，0.5μL Taq DNA聚合酶，18.5μL去离子水。反应条件：95℃预变性3 min；96℃1 m in、60℃15 s共40个循环，60℃延伸时采集荧光信号。所有PCR反应均在LightCycler核酸扩增仪上进行。比较单独药物PTX及PTX-SRM的疗效差异。各基因引物及序列见表1。

表1 各基因引物及序列

1.3.4 按照1.2.2实验分组，Western-blot检测 α-SMA、E-cadherin、Vimentin蛋白表达：制备聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，将蛋白样品20μg加入上样孔，进行80 V／120 V电泳，转移到PVDF膜；1×TBST洗涤，加5%脱脂奶粉37℃封闭1 h；加入α-SMA、E-cadherin、Vimentin兔抗人单克隆抗体（1∶200）和β-actin兔抗人单克隆抗体（1∶400），4℃孵育过夜；1×TBST洗涤3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000），37℃孵育1 h，曝光、分析。比较单独药物PTX及PTX-SRM的疗效差异。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0对实验数据进行处理分析，计量资料采用“±s”，组间比较采用t检验，计数资料采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测PTX对BEC的影响

MTT法检测48 h时PTX对BEC的IC50为213.8 nM，因此我们选择250 nM进行后续实验（见图1）。

图1 不同浓度紫杉醇对胆管上皮细胞增殖的抑制率Fig.1 The rate of Inhibition on the proliferation of bile duct epithelial cell in different concentrations of paclitaxel

2.2 MTT法检测PTX-SRM及PTX对BEC增殖的影响按照1.2.1实验分组，MTT法检测 0、24 h、48 h、72 h各个时间点、不同组的细胞增殖情况。结果显示：无载药的SRM对BEC也具有一定的抑制作用；100 nM PTX-SRM与250 nMPTX在48 h时间点对细胞抑制率无差别，48 h以后仍有抑制作用（P＜0.05），而250 nM PTX-SRM较250 nM PTX可以有效抑制BEC的增殖（P＜0.05），48 h抑制效果最好，72 h抑制率略有下降；500 nM PTX-SRM较250 nMPTX具有更加明显抑制细胞增殖效果（P＜0.05）。PTX-SRM抑制BEC的增殖具有浓度依赖性，高浓度PTX-SRM产生的细胞增殖抑制作用可能是由于PTX的毒性引起。本实验中选用250 nM PTX-SRM进行后续试验。（见图2）。细胞增殖药效（见图3，图4）。

图2 PTX-SRM及PTX对胆管上皮细胞增殖的影响*P＜0.05，与SRM组相比；＃P＜0.05，与单纯PTX处理组相比Fig.2 Effect of PTX-SRM and PTX on bile duct epithelial cells proliferation*P＜0.05，compared with SRM group；＃P＜0.05，conpared with single PTX treatment group

图3 PTX-SRM及PTX对TGF-β1诱导的E-cadherin、Vimentin和α-SMA mRNA表达的影响*P＜0.05，与对照组相比；＃P＜0.05，与单纯PTX处理组相比Fig.3 Effect of PTX-SRM and PTX on the expression of E-cadherin，Vimentin andα-SMA mRNA induced on TGF-β1*P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with single PTX treatment group

2.3 PTX-SRM及PTX对TGF-β1诱导BEC的上皮标志物（E-cadherin）和间叶标志物（Vimentin和 α-SMA）mRNA及蛋白水平表达的影响。

按照1.2.2实验分组，Real-time PCR结果显示：与对照组相比，TGF-β1可以诱导BEC的上皮标志物E-cadherinmRNA及蛋白表达下降，而Vimentin和α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。48 h时，单纯 PTX组和 PTX-SRM组均升高了上皮标志物E-cadherin mRNA及蛋白表达，而降低了间叶标志物Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05）。而72 h时，单纯PT组的E-cadherinmRNA及蛋白表达水平较48 h降低，但仍高于TGF-β1组，Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表达水平较48小时升高，但低于 TGF-β1组（P＜0.05）；而PTX-SRM组各指标的mRNA及蛋白表达水平基本与48 h持平。72小时后，PTX-SRM组E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较单独使用PTX高，而Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表达水平低（P＜0.05），说明PTX-SRM较单纯PTX组有持续性的抑制

图4 PTX-SRM及PTX对TGF-β1诱导的 E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达的影响Fig.4 Effect of PTX-SRM and PTX on the expression of E-cadherin，Vimentin andα-SMA protein induced on TGF-β1

3 讨论

胆管在肝脏外侧的节段管壁比较薄，含有丰富的弹性纤维。随着医学科技水平的发展，微创手术已经变的非常普及，尤其是腹腔镜下进行腹部手术时，很容易医源性的对胆管造成刮痕［3-4］。目前胆道瘢痕形成的具体机制不甚清楚。研究认为［5-6］上皮细胞可以发生上皮-间叶样细胞表型转化EMT。EMT后上皮细胞失去了极性，获得了间质样细胞的表型，表现为E-钙黏蛋白等上皮性细胞标志物表达下调，α-SMA、Vimentin等间叶细胞标志物表达上调，细胞的运动和侵袭能力增强，其中α-SMA被认为是肌成纤维细胞特异性的标记物。目前对于胆管上皮细胞是否参与EMT的研究很少。当胆管出现损伤，在炎性介质特别是TGF-β1刺激下会激活大量的成纤维细胞活化、增殖，过多的成纤维细胞会堆积在胆管管壁并部分转化为肌成纤维细胞，进一步引起导管挛缩、细胞外基质增多，导致管壁增生，引发胆道狭窄甚至闭锁，造成严重的并发症［7-8］。本研究利用TGF-β1与胆管上皮细胞共培养，模拟胆道损伤的微环境，我们观察到TGF-β1刺激胆管上皮细胞后，胆管上皮细胞形态发生了明显改变，呈现梭形成纤维细胞样改变；胆管上皮细胞标识物E-cadherin蛋白及基因表达下调，而间叶标识物α-SMA、vimentin蛋白及基因表达上调，说明TGF-β1可使胆管上皮细胞发生EMT。本实验证实胆管上皮细胞同样可以发生EMT，EMT后肌成纤维细胞数量进一步增加，细胞外胶原增多，促进胆管瘢痕狭窄。当前临床对逆转胆管上皮细胞EMT的良药尚未研制成功，只能等到胆道发病之后使用手术切除或扩撑的方法。因此寻找一种安全有效的药物对良性瘢痕纤维化进行抵抗，成为了当前研究的热点。本研究发现紫杉醇与紫杉醇-壳聚糖缓释膜均能抑制胆管上皮细胞的增殖。与单纯PTX用药组相比，低、中浓度的PTX-壳聚糖缓释膜可以更长时间的有效抑制胆管上皮细胞的增殖。单纯PTX组对胆管上皮细胞的抑制率在48 h达到最高，然后逐渐降低，72 h后抑制效果显著下降。而低、中浓度的PTX-壳聚糖缓释膜在72 h时仍能保持对胆管上皮细胞的抑制。高浓度PTX-壳聚糖缓释膜能够显著性抑制细胞增殖，且抑制率最高，说明在该浓度下，细胞的增殖抑制可能是因为PTX的毒理作用，这对于体内用药的实际情况没有意义。我们猜测不同浓度之间的紫杉醇-壳聚糖缓释膜的机理不尽相同：高浓度的PTX-壳聚糖缓释膜可以阻滞胆管成纤维细胞周期于G2／M期，并最终导致细胞凋亡；而低、中浓度的PTX-壳聚糖缓释膜能使细胞阻滞于G1期，但并不会引起细胞凋亡，主要是抑制细胞分裂、迁移、转化和细胞外基质合成等一系列微管相关功能，故本实验选择250 nM PTXSRM进行试验。另外通过对比紫杉醇-壳聚糖缓释膜与单独紫杉醇对胆管上皮细胞蛋白、基因表达的影响，发现紫杉醇-壳聚糖缓释膜能更好的抑制E-cadherin蛋白及基因表达下调，以及α-SMA、vimentin蛋白及基因表达上调，其疗效明显优于单独使用紫杉醇。为临床上以纤维化为主的胆道疾病，如肝胆管结石病、硬化性胆管炎和胆道肿瘤等提供新的的治疗方法。

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（编校：吴茜）

Research on optimum resistance factors of paclitaxel against benign biliary scar fibrosis

SONG Fei1，XIANG Ying-ying2，ZHANG Xiao-wen1Δ

（1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China；2.Department of Stomatology，The Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650051，China）

ObjectiveTo discuss the best resistance factors of paclitaxel（Taxinol）on benign biliary scar fibrosis，in order to provide an effective basis for clinical prevention and treatment of benign biliary scar fibrosis.MethodsHuman bile ductepithelial cellswere cultured in vitro，the prepared PTX at0.001 uM，0.005 uM，0.1 uM，0.5 uM and 1 uM concentration were separately added into cells for48 h.The half inhibitory rate of BEC（IC50）were determined by MTT and the optimal concentration were confirmed.Human bile ductepithelial cellswere cultured in 0 h，24 h，48 h and 72 h，the inhibitory rate of BEC at 100 nM，250 nM，and 500 nM PTX-Chitosan Sustained release membranes and the optimal concentration of PTX were determined by MTT and the optimal concentration of PTX-SRM were obtained.Human bile duct epithelial cells were cultured for 48 h and 72 h，the mRNA and protein expression ofα-SMA，E-cadherin，Vimentin were detected by Western Blot and Real-time PCR methods.ResultsThe optimum resistance concentration of PTX to benign biliary scar was 250 nM.PTX and PTX-SRM could effectively inhibit the proliferation and transformation of BEC，and the best effective treatments to resist benign biliary scar fibrosiswere low and middle concentrations of PTX-SRM，the best drug loadingwere 100 nM and 250 nM.The inhibition duration of PTX-SRM on BEC was longer than PTX alone（P＜0.05）.ConclusionThe inhibition of PTX-SRM on BEC proliferation and transformation isbetter than the single drug of PTX，which provides a new scientific and feasiblemethod for clinicalprevention and treatment of benign biliary scar.

paclitaxel；benign fibrosis；resistance；chitosan sustained releasemembrane

R33；R285.5

A

1005－1678（2014）03－0012－04

良性胆管瘢痕是指由于胆道手术，胆道细菌、病毒感染，以及结石炎症等原因导致的胆管管道瘢痕［1］。当胆管产生瘢痕的同时，也有大量的炎性介质产生，特别是转化生子因子-b1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）诱导胆管粘膜下自身的成纤维细胞通过增殖生长对瘢痕部位进行修复，导致胆管管壁增生引发胆管狭窄甚至闭锁［2］，产生一系列不良的病状。但对TGF-b1诱导胆管上皮细胞（biliary epithelial cell，BEC）发生上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transitions，EMT）转化成肌成纤维细胞的报道很少。当前临床对胆道闭锁以及狭窄常规的治疗方法为手术治疗，但手术治疗的质量较低，常会引发胆道良性瘢痕的再生，因此选择一种能避免此现象且对良性胆管瘢痕具有高效安全作用的治疗药物成为目前研究热点。本研究采用自制不同浓度紫杉醇-N-琥珀酰化羟乙基壳聚糖缓释膜和单独紫杉醇（Paclitaxel；taxinol，PTX；Taxol）用药对胆管上皮细胞增殖及转化进行对比，探索抗良性胆管瘢痕纤维化的最佳抵抗因素。

国家自然科学基金地区科学基金项目（81260084）

宋飞，男，博士，研究方向：肝胆胰外科，E-mail：85291753＠qq.com；张小文，通信作者，男，博士，主任医师、教授，研究方向：肝胆胰外科，E-mail：283073084＠qq.com。