王迎春，哈敏文，王彦，刘维，李满

（辽宁医学院附属第一医院 综合一病区，辽宁 锦州 121001）

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胰腺癌细胞株Capan-2增殖及其PCDH8基因表达的影响

王迎春，哈敏文Δ，王彦，刘维，李满

（辽宁医学院附属第一医院 综合一病区，辽宁 锦州 121001）

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）对胰腺癌细胞株增殖的影响以及对其原钙黏附素（protocadherin 8，PCDH8）基因表达的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理胰腺癌Capan-2细胞。阴性对照组不加药，根据5-Aza-CdR处理的剂量分为：0.08μmol／L组、0.40μmol／L组、2.00μmol／L组、10μmol／L组、50μmol／L组，检测细胞的生长情况；采用RT-PCR和Western Blot检测各组胰腺癌细胞PCDH8基因和蛋白的表达。结果5-Aza-CdR对胰腺癌细胞具有明显的抑制作用，且随着浓度的增加，抑制率逐渐增强（P＜0.01）；但是随着时间的增加，抑制率逐渐下降（P＜0.01）。5-Aza-CdR和吉西他滨联用对胰腺癌细胞的抑制作用和诱导凋亡作用最强（P＜0.05，P＜0.01）。5-Aza-CdR能显著增加胰腺癌细胞PCDH8基因和PCDH8蛋白的表达水平，且随着浓度的升高，增加作用越明显（P＜0.01）。结论5-Aza-CdR能够抑制胰腺癌细胞的增殖，增加PCDH8基因的表达，与吉西他滨联合后抑制作用更强。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷；胰腺癌；PCDH8基因

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 试验细胞为人胰腺癌细胞株Capan-2细胞系（上海艾研生物科技有限公司提供）。RPMI 1640培养基（上海博升生物科技有限公司）。主要试剂有5-Aza-CdR（TaKaRa公司）；MTT、胰蛋白酶（Sigma公司）；RNA提取试剂盒、蛋白提取试剂盒（英诺生物）；鼠抗人PCDH8单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体（艾美捷科技有限公司）。easyCyte 8流式细胞仪（Guava，美国），Auto2000细胞计数器（Nexcelom公司，美国），ScanDrop 100蛋白定量仪（耶拿分析仪器股份公司，德国）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 人胰腺癌细胞Capan-2细胞37℃水浴复苏，1000 r／min离心10 min，留沉淀。细胞进行培养、消化、传代，细胞生长到对数生长期时，将细胞制成单细胞悬液，调整浓度为2×103个／孔，接种于96孔板，每5个复孔为1组，在37℃，5%CO2条件下进行培养。

1.2.2 药物处理 显微镜下可见细胞单层贴壁后进行分组加药处理。阴性对照组不加药，根据5-Aza-CdR处理的剂量分为：0.08μmol／L组、0.40μmol／L组、2.00μmol／L组、10μmol／L组、50μmol／L组。5-Aza-CdR与吉西他滨联合作用评价：Ⅰ组加入吉西他滨 20μmol／L，Ⅱ组加入 5-Aza-CdR 0.12μmol／L，Ⅲ组加入吉西他滨和5-Aza-CdR，对照组不加药物。

1.3 观察指标 每组药物处理24 h、48 h、72 h后，采用MTT法测定细胞存活率，在OD值490 nm处测定吸光值。抑制率＝（阴性对照组OD值-加药组OD值）／阴性对照组OD值×100%。细胞凋亡检测采用Annexin V-FTIC／PI双染法，凋亡率＝凋亡细胞数／总细胞数。胰腺癌细胞PCDH8基因表达检测：分别以不同浓度（0、0.4、2.0、10.0μmol／l）5-Aza-CdR处理胰腺癌细胞，培养4 d后提取细胞基因组总RNA，测定RNA浓度和纯度，对完整性进行鉴定。之后逆转录合成cDNA，RT-PCR检测PCDH8基因的表达。细胞PCDH8蛋白表达检测：将1×106个细胞／瓶接种于培养瓶内，分别加 0、0.4、2.0、10.0μmol／L 5-Aza-CdR处理4 d，之后提取细胞蛋白，Western Blot检测细胞PCDH8蛋白表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0分析数据，正态计量资料采用“±s”表示，采用F检验或t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对胰腺癌细胞的抑制作用 5-Aza-CdR对胰腺癌细胞具有明显的抑制作用，在一定浓度范围内，随着浓度的增加，抑制率逐渐增强，当浓度达到50.00μmol／L时，抑制率出现下降情况（P＜0.01）。随着作用时间延长，抑制率逐渐下降（P＜0.01，见表1）。

表1 5-Aza-CdR对胰腺癌细胞的抑制作用（%）Tab.1 Inhibition effect of5-Aza-CdR on pancreatic cancer cell（%）

2.2 5-Aza-CdR联合吉西他滨对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响 药物处理后，各加药组OD值均明显下降，其中以联合组下降幅度最大，说明联合组对胰腺癌细胞增值的抑制作用最强，与单独5-Aza-CdR组和吉西他滨组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）；细胞凋亡率也属联合组的最高，与其他2组差异有统计学意义（P＜0.05）。5-Aza-CdR组和吉西他滨组在抑制率和凋亡率上无明显差异（见表2）。

表2 5-Aza-CdR联合吉西他滨对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响Tab.2 Results of 5-Aza-CdR and gemcitabine on pancreatic cancer cell proliferation and apoptosis

2.3 不同浓度5-Aza-CdR对胰腺癌细胞PCDH8基因和PCDH8蛋白表达的影响 正常胰腺癌细胞不表达PCDH8基因和其蛋白，经5-Aza-CdR诱导后表达，且随着5-Aza-CdR浓度增加，表达逐渐增多（见表3，图1）。

图1 PCDH8基因（a）和蛋白（b）表达Fig.1 PCDH8 gene and protein expressionM：DS2000 DNA marker；1.对照组；2.0.4μmol／L 5-Aza-CdR组；3.2.0μmol／L 5-Aza-CdR组；4.10.0μmol／L 5-Aza-CdR组；5.β-actin

3 讨论

5-Aza-CdR是去DNA甲基化抑制剂，通过与DNA甲基化转移酶结合，逆转基因甲基化过程，恢复基因表达和功能［6］。白和平等［7］研究显示5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸可抑制人乳腺癌细胞的生长，其抑制率与药物浓度、作用时间呈依赖关系，与5-Aza—CdR去甲基化，促进RUNX3基因及蛋白表达有关。黄铀新等［8］研究显示5-氮杂-2’-脱氧胞苷能有效抑制DLK1基因的表达，从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力。张洪典等［9］研究显示5-Aza-CdR能够逆转BNIP3基因在ESCCKyse-140细胞株中的高甲基化状态，解除DNA高甲基化导致的基因沉默，从而恢复其mRNA和蛋白水平的表达，同时显著抑制细胞的生长和增殖能力（P＜0.01）。吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢物抗癌药，是去氧胞苷的水溶性类似物，是核糖核苷酸还原酶的一种抑制性酶的替代物，这种酶在DNA合成和修复过程中，对脱氧核苷酸的生成至关重要［10-11］。既往吉西他滨是治疗晚期胰腺癌的主要药物，但是患者的的1年生存率仍然很低，而中位生存期只有5.4～5.6个月。联合5-Aza-CdR和吉西他滨作用于胰腺癌细胞，结果显示，其对胰腺癌细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡的作用强于单用2种药物，说明2者具有协同作用。

PCDH8属于钙黏附素家族的一个亚族，其整体结构与其他原钙黏附素很相似，与其他钙黏附素家族成员具有高度的同源性［12］。原钙黏附素具有介导细胞间的黏附作用的能力，但其黏附性较经典钙黏附素弱。目前PCDH8基因被认为是一种潜在的抑癌基因。石宇良［13］等研究显示PCDH8基因的表达能降低鼻咽癌细胞的增殖、侵袭能力，延缓细胞分裂周期。PCDH8的表达缺失、甲基化、杂合性缺失可能与肿瘤细胞的快速增殖相关［14］。PCDH8在胰腺癌细胞中不表达，可能是因为PCDH8在胰腺癌细胞中发生异常高甲基化。经过5-Aza-CdR处理后，胰腺癌Capan-2细胞中PCDH8发生去甲基化，从而恢复基因表达，发挥抑制胰腺癌细胞生长的作用。本研究结果显示：5-Aza-CdR能够显著增加PCDH8基因和PCDH8蛋白的表达，在一定浓度范围内，随着浓度的增加，抑制率逐渐增强（P＜0.01），当浓度为50.00μmol／L时，抑制率出现下降情况，尤其在作用48 h以及72 h时，下降明显，具体原因还不十分明确。

综上所述，5-Aza-CdR能够抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导其凋亡，且与吉西他滨具有协同作用，其可能机制为5-Aza-CdR通过抑制PCDH8基因甲基化增加PCDH8基因和PCDH8蛋白表达。

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（编校：吴茜）

Effect of 5-Aza-CdR on pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation and PCDH8 gene expression

WANG Yin-chun，HA Min-wenΔ，WANG Yan，LIUWei，LIMan

（Comprehensive Ward One，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of 5-Aza-CdR on pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation and PCDH8 gene expression.MethodsPancreatic carcinoma Capan-2 cellswere treated with different doses of5-Aza-CdR with orwithout gemcitabine，negative control group without drug，0.08μmol／L group with 0.08μmol／L 5-Aza-CdR，0.40μmol／L group with 0.40μmol／L 5-Aza-CdR，2.00μmol／L group with 2.00μmol／L 5-Aza-CdR，10μmol／L group with 10μmol／L 5-Aza-CdR，50μmol／L group with 50μmol／L 5-Aza-CdR.The inhibition ratio of Capan-2 cell proliferation were observed by MTT assay and PCDH8 gene and protein expression were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe inhibition ratio was increased with 5-Aza-CdR dose increasing（P＜0.01），but decreased apparently with times extending（P＜0.01）.Inhibition ratio in 5-Aza-CdR and gemcitabine group was higher than thosewith only 5-Aza-CdR or gemcitabine groups（P＜0.05 or P＜0.01）.The levels of PCDH8 gene and protein expression were increased significantly in 5-Aza-CdR treatment groups，with dose dependent（P＜0.01）.Conclusion5-Aza-CdR can inhibit the proliferation of pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation，and increase PCDH8 gene expression.The inhibition effect is strongwhen combined with gemcitabine.

5-Aza-CdR；pancreatic carcinoma；PCDH8 gene

R735.2

A

1005－1678（2014）03－0016－03

胰腺癌是常见的胰腺肿瘤，是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率＜1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，发现时往往已经失去了手术治疗的最佳时机，加上其具有高度的侵袭性，因此患者预后较差，死亡率较高，总体生存率较低。原钙黏附素（protocadherins，PCDHs）属于钙黏附素家族，研究显示其在一些肿瘤中具有抑制肿瘤生长、转移的作用［1-3］。5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一种胞嘧啶类似物，是甲基化抑制剂，具有较强的去甲基化作用［4-5］。本研究采用5-Aza-CdR处理胰腺癌细胞，旨在探讨其对胰腺癌细胞增殖及PCDH8表达的影响。

辽宁省科技厅课题（2012225019）

王迎春，女，本科，中级职称，研究方向：肿瘤的临床治疗，E-mail：huangdan0130＠126.com；哈敏文，通信作者，男，博士，教授、主任医师、硕士生导师，研究方向：肿瘤的临床治疗，E-mail：huangdan0130＠126.com。