王 瑞,李东风,王 辉,胡成栋,陈怀志,王 飞,刘法敬

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

二膦酸盐类药物伊班膦酸钠作为一种可以抑制恶性肿瘤骨转移的有效药物，能强效抑制骨吸收，缓解骨质破坏所导致的骨痛，同时可增加骨质的强度[1]。目前，国内临床研究的热点多集中在伊班膦酸钠对骨转移瘤局部疼痛的缓解作用，而该药物对转移灶内癌细胞的抑制作用却缺乏较深入的研究。本研究借助体外培养的小细胞肺癌溶骨性骨转移瘤细胞来分析不同浓度伊班膦酸钠对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，为临床应用伊班膦酸钠治疗溶骨性骨转移瘤提供理论依据。

1 实验资料

1.1实验材料 骨磨片：新鲜成年牛皮质骨，磨成100 μm厚的骨磨片，超声清洗30 min，-30 ℃冻存备用。用时解冻，70%乙醇浸泡30 min，超净工作台中紫外线照射1 h。主要试剂：RPMI 1640细胞培养液、胰蛋白酶(美国Cellgro公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，四唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(河北博海生物工程有限公司)，Bcl-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体(美国Santa cruz公司)，伊班膦酸钠注射液(艾本)1 mL：1 mg，由河北医科大学生物医学工程中心提供。

1.2实验方法

1.2.1肿瘤组织的取材、细胞培养、筛选及纯化 选择6例小细胞肺癌溶骨性骨转移的患者(既往经病理确诊)，于术中无菌条件下切取转移灶实体肿瘤组织即进行细胞培养。将原代培养的混杂生长细胞进行分离、纯化，制备成最终的细胞悬液。

1.2.2实验分组 将纯化后的肿瘤细胞接种于25 mL细胞培养瓶中，加入RPMI 1640细胞培养液，于恒温培养箱中培养24～48 h。待贴壁时，去培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化液1～2 mL，消化5～7 min，镜下观察细胞回缩呈圆形，细胞间隙增大，终止消化。加入培养液并反复吹打瓶壁，获得单细胞悬液，调整细胞密度为1×104mL-1，接种于96孔细胞培养板中。然后随机分2组:A组为对照组(单细胞悬液+同等质量分数的0.9%NaCl)；B组为伊班膦酸钠治疗组。均设6个浓度梯度，加入药物浓度分别为2，4，8，16，32，64 μg/mL。以上各组分别设3个复孔。置于恒温培养箱中培养48 h，培养期间注意观察培养液性状，如有必要则换液1次。48 h后用MTT法测定各组吸光度值(OD值)，求得各组抑制率=(1-A试验组/A对照组)×100%，然后计算出伊班膦酸钠在对溶骨性骨转移瘤细胞作用研究中的IC50(4.223 μg/mL)值，并依此为依据，确定最终实验浓度为4 μg/mL，设置2，8 μg/mL为研究组。

1.2.3形态学观察 将密度为1×107L-1的细胞悬液接种到无菌96孔细胞培养板上，设不同浓度的实验组和对照组，每组3个复孔，共计12孔，每孔加入100 μL细胞悬液置培养箱内培养24 h。待细胞贴壁生长后更换培养液，并加入不同浓度的伊班膦酸钠，对照组加入同等质量分数的0.9%NaCl，继续培养48 h后，光镜下观察细胞形态学改变。将预先制备的牛皮质骨磨片解冻，裁剪成4 mm×4 mm大小，70%乙醇浸泡30 min，超净台中紫外线照射1 h后，与1×108mL-1的细胞悬液共同培养于25 mL的培养瓶中。依照实验分组共计为4个培养瓶，每瓶中加入3张骨磨片。培养箱内培养24 h，细胞贴壁生长后，更换培养液同时按实验分组加入不同浓度的伊班膦酸钠。分别于第7，10天各取出1张骨磨片，0.25%胰蛋白酶消化液消化10 min，超声清洗30 min,用生理盐水反复冲洗，直至镜下观察骨磨片上无细胞附着，骨陷凹及哈弗管清晰可见，观察对比不同药物浓度、不同时间下的骨陷凹形态、密度等。

1.2.4四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖抑制情况 试验所用的显色剂-四唑盐是一种能接受氢原子的化学染料，又名噻唑兰(MTT)，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的噻唑兰还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞内，而凋亡细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值(A)，可间接反映存活细胞数量，在一定的细胞数量范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数目成正比。取对数生长期细胞，经消化后制备成浓度为1×107L-1的细胞悬液，按试验分组情况接种到无菌96孔细胞培养板上，每孔加入细胞悬液100 μL，每组设3个复孔。于细胞培养箱内培养24 h，待细胞贴壁后更换培养液，试验组加入不同浓度的伊班膦酸钠溶液，对照组加入同等质量分数的0.9%NaCl。继续放入培养箱内培养，并按时间梯度(24,48,72 h)依次采集细胞，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，继续培养4 h后吸弃培养孔内的上清液，然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，使蓝紫色结晶物充分溶解。于酶联免疫检测仪上，选择490 nm波长，测定各孔A，计算细胞增殖抑制率(CI)=(1-A试验组/A对照组)×100%，对比各组的细胞增殖抑制率的差异。

1.2.5细胞凋亡相关基因Bcl-2与Bax表达的检测 采用间接免疫荧光标记的方法。检测前去除待测样本中70%的乙醇，并用PBS缓冲液洗涤2次，每份待测样本细胞计数调整为1×109L-1，加入Bcl-2与Bax鼠抗人单克隆抗体(一抗)0.1 mL，工作液浓度为1∶100，37 ℃水浴箱中温浴30 min，再次PBS缓冲液洗涤2次，离心移弃上清；然后在每份样品中加入羊抗鼠FITG-IgG(二抗)100 μL，工作液浓度1∶100，避光37 ℃孵箱内孵育30 min后PBS缓冲液洗涤2次，移弃上清，以去除未接合的多余荧光二抗。样本中加入0.1 mL PBS缓冲液后上机检测Bcl-2与Bax蛋白表达情况。每份样本检测1×105个细胞，每组检测3个样本并重复3遍。以荧光指数(FI)表示蛋白表达定量分析的相对含量，公式为FI=(样本蛋白的平均荧光强度-正常对照样本平均荧光强度)/正常对照样本平均荧光强度，FI>1.0为阳性表达，FI≤1.0则为阴性表达。

1.3统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件包进行分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1细胞形态学观察结果 倒置相差显微镜下观察，可见对照组细胞生长良好，细胞密度较大，相互连接，呈梭形或不规则多边形。细胞透明度大、折光性强、轮廓不清。高倍镜下可部分细胞细微结构，细胞核隐约可见，胞浆内颗粒含量少。实验组细胞数明显减少，细胞折光性减弱，轮廓增强，胞浆内出现空泡、脂滴等颗粒样物质。细胞失去原有形态，贴壁性减弱，培养液中漂浮细胞数目和崩解的细胞碎片明显增多，且有明显时间及浓度梯度依赖。镜下可见对照组中的骨磨片吸收陷窝较多、较深，相互连接成片，呈现梅花状、串珠状，而试验组骨磨片骨吸收陷窝形成减慢，数量减少，陷窝多呈单个圆形，难以连接成片，同样存在时间和浓度梯度依赖性。

2.2细胞增殖抑制试验结果 采用MTT法测定细胞增殖抑制率，显示在初始接种等量细胞数目的前提下，对照组MTT结晶物多于各实验组，其A值显著高于试验组；而实验组A值则呈现随浓度梯度上升逐渐下降的趋势，其细胞增殖抑制率逐渐增高。见表1。

2.3Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达情况 流式细胞仪间接荧光发检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白基因表达相对含量，各浓度试验组处理小细胞肺癌细胞48 h后均使Bcl-2蛋白表达相对含量FI≤1.0(即阴性表达)，随着作用剂量的增加，Bcl-2蛋白表达相对含量逐渐降低，对照组无变化，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2组Bax蛋白表达相对含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 2组不同时点吸光度比较

注：①与对照组比较,P<0.05;②与24 h时比较,P<0.05;③与48 h时比较,P<0.05。

表2 48 h各组骨转移瘤细胞Bcl-2与Bax蛋白的相对表达%)

注：①与对照组比较,P<0.05。

3 讨 论

二膦酸盐是目前在治疗骨质疏松和恶性骨转移瘤所致顽固性骨痛方面的临床一线用药。现已研究证实二膦酸盐作用的最终靶细胞为破骨细胞，二膦酸盐通过3种作用方式来抑制破骨细胞的生物学活性[2]：①抑制破骨细胞的形成；②抑制破骨细胞的细胞功能；③促进破骨细胞凋亡，缩短细胞寿命。小细胞型肺癌生长迅速，恶性度高，5 a存活率仅1%～2%，且较早发生转移。骨骼是小细胞肺癌的常见转移部位，发生率约为42.2%，其中约80%为溶骨性骨质破坏。

在本实验中，应用了不同药物浓度的伊班膦酸钠，分别作用于原代培养的小细胞肺癌溶骨性骨转移瘤细胞，并设立了严格的对照组。MTT结果显示2 μg/mL组伊班膦酸钠作用于细胞24 h后，即可出现细胞增殖受到抑制的现象，4 μg/mL组伊班膦酸钠作用于细胞24 h后，这种增殖抑制现象显著增强，当药物浓度增加至8 μg/mL，且作用时间为72 h的时候，增殖抑制现象达到峰值高度。由此认为不同药物浓度的伊班膦酸钠在体外均可以抑制小细胞肺癌溶骨性骨转移瘤细胞的增殖，且这种增殖抑制现象具有浓度-时间依赖性。

凋亡异常与恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关。笔者发现，经不同药物浓度干预后的溶骨性骨转移瘤细胞，在光镜下出现细胞固缩，细胞间隙增大，细胞膜折光性减弱，轮廓增强，胞浆内颗粒样物质增多，细胞核区凝聚(核固缩)，细胞贴壁性减弱，培养液中漂浮细胞数目和崩解的细胞碎片明显增多，存活细胞数减少；而对照组细胞形态无明显变化。流式细胞仪检测显示，2 μg/mL组伊班膦酸钠作用于细胞24 h后，即可检测到凋亡峰，而对照组未检测到凋亡现象。并且凋亡率随药物浓度的增加而增大，当药物浓度增加至8 μg/mL时，细胞凋亡值达到峰值凋亡率19.20%。

伊班膦酸钠在体外抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的主要机制之一是具有直接诱导肿瘤细胞凋亡的能力[3]。有报道Bcl-2是许多生理性细胞凋亡的关键性调节因子，在细胞凋亡的内源性共用通道调节上起到至关重要的作用，Bcl-2蛋白定位于线粒体膜、内置网膜和核膜上，它的主要细胞生物学功能是延长细胞的生理寿命并增加细胞对凋亡刺激因子的抗性，其过度表达可以减少细胞凋亡，使机体引发增殖性疾病和/或恶性肿瘤[4-5]。Bax蛋白是由p53基因直接激活的，其功能是提高基因家族的敏感性，促进由p53介导的细胞凋亡[6-7]。本实验通过流式细胞术分析显示伊班膦酸钠在体外可使溶骨性骨转移瘤细胞凋亡抑制基因Bcl-2表达减弱，而对凋亡基因Bax的表达无显著性影响。这一现象表明，伊班膦酸钠在体外促进肿瘤细胞凋亡的机制之一是通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的过度表达而实现的。

因此，在体外实验条件下不同浓度的伊班膦酸钠均能够抑制转移性小细胞肺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，调控Bcl-2蛋白的表达，并呈现浓度和时间依赖性。

[参考文献]

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