徐 敏 鲍 芳 乔鲁军

(东营市胜利油田中心医院，山东 东营 257000)

随着老龄化社会的到来，重症医学科(ICU)收治的脓毒症患者亦趋于老龄化，老年患者常并发各种器官功能不全，更易发展为脓毒症休克、多器官障碍综合征(MODS)〔1～3〕。因此治疗药物的选择上更加慎重，乌司他丁作为改善炎症反应的药物，近年来在使用安全上有较好的优势，但其疗效及使用剂量上仍有不同的意见〔4～6〕。本实验通过LPS干预EPCs后加入不同剂量的乌司他丁以检测EPCs增殖、迁移功能，来模拟LPS诱导脓毒症后，乌司他丁对EPCs的作用，以期在细胞水平观察乌司他丁对脓毒症的影响。

1 材料与方法

1.1EPCs来源 采集健康志愿者外周静脉血，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，铺板并培养，PBS除去非贴壁细胞并继续培养至7 d。

1.2EPCs鉴定 将贴壁细胞与DiI-acLDL(2.4 μg/ml) (Biomedical公司，美国)在 37℃下共孵育1 h后检测 DiI-acLDL的摄取量。2%多聚甲醛固定细胞10 min后PBS漂洗。37℃下与FITC-UEA-I (10 μg/ml) (Vector 公司，美国) 孵育1 h。最后采用激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope， LSCM，Zeiss公司，德国)观察，若细胞呈现Dil-acLDL和UEA-I双染色阳性，说明EPCs鉴定成功。

1.3实验分组 贴壁细胞随机分成4组：①空白对照组：EGM-2MV标准液培养EPCs 48 h。②LPS组：采用EGM-2MV标准液配置的LPS液(100 ng/ml)培养EPCs 48 h。③乌司他丁-1、-2、-3组：采用EGM-2MV标准液配置的LPS液(100 ng/ml)培养EPCs 24 h后，再用前述LPS液配置的三种不同浓度乌司他丁液(100、200、400 IU/ml)培养EPCs 24 h。因细胞对培养液营养成分的需求，每24小时换液1次。

1.4增殖功能检测 EPCs经过3 d的传代培养，用PBS洗除非贴壁细胞，胰蛋白酶消化并离心(1 500 r/min)。除去上液，将细胞悬浮于EGM-2MV标准液，调节细胞浓度至1×105/ml。接种EPCs到96孔板，每孔加100 μl细胞悬浮液。24 h后去除上清液，加入EGM-2MV使细胞同步化，光学相差显微镜观察每孔内细胞生长均匀。……