时英英 杨 靖 时学秀 单 杰

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450052)

转录因子BTB-CNC同源异构体(Bach)1属于CNC转录因子家族，在体内广泛存在，它是一种碱性亮氨酸拉链蛋白，其包含一个碱性亮氨酸拉链结构域和一个锌指结构域，二者皆与Bach1的转录调控作用有关〔1〕。关于Bach1的研究主要集中在其对血红素氧化酶1(HO-1)的作用上。HO-1具有抗氧化、抗凋亡等效应，实验证实HO-1是一类保护细胞及抗氧化损伤的酶类，其表达可通过许多转录因子进行调控。Bach1在核内抑制HO-1的表达〔2〕。

1 材料与方法

1.1材料 大肠杆菌菌株E.Coli.DH5α、质粒pBI-EGFP、质粒pTet-Off、人肝癌细胞系SMMC-7721：本室保存；质粒pQE30-Bach1：美国教授馈赠；限制性核酸内切酶NheⅠ，MluⅠ，KpnⅠ，HindⅢ：Fermentas公司；PCR产物纯化试剂盒：上海捷瑞生物工程股份有限公司；RPMI1640培养基：Gibco公司； 无支原体胎牛血清：北京索来宝公司；脂质体2000转染试剂：Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒：华北制药集团有限公司。

1.2重组质粒pBI-EGFP-Bach1的构建

1.2.1目的基因Bach1的获取 采用CaCl2法制备感受态细菌，质粒pQE30-Bach1转化进大肠杆菌DH5α，使用质粒提取试剂盒小量提取质粒,从提取的质粒 DNA中吸出少量,适当稀释,使用紫外分光光度仪测定 OD260,计算质粒浓度，双酶切鉴定质粒pQE30-Bach1，PCR扩增Bach1片段，PCR产物纯化回收，1%琼脂糖凝胶电泳检测,使用凝胶成像系统分析酶切结果。

1.2.2构建重组质粒pBI-EGFP-Bach1双酶切 处理质粒载体pBI-EGFP及目的基因Bach1，1%琼脂糖凝胶电泳后,使用胶回收试剂盒按说明书分别回收pBI-EGFP和Bach1，纯化后片段在 T4 DNA连接酶作用下进行连接，连接反应产物转化感受态细菌，提取并鉴定重组质粒。……