何丽娟 宋 囡 何文智 孙月娇 初 杰 任艳玲

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，在体内是成骨细胞的主要来源〔1〕；在体外实验中，BMSCs诱导分化为成骨细胞得到了肯定。已经证明的诱导方法有很多〔2，3〕，但是有关中药汤剂诱导BMSCs骨向分化的报道尚不多见。左归丸的主要功效是填肾精、益骨髓，右归丸的主要功效是补命火，壮肾阳。本课题组前期体外研究已经表明左、右归丸及其拆方含药血清能协同诱导剂促进 BMSCs 成骨分化，左归丸和滋肾阴药的诱导作用优于右归丸和补肾阳药〔4〕。但是其诱导机制尚不明确。本实验通过转化生长因子(TGF)-β1/Smad4信号转导途径，进一步探讨左、右归丸对BMSCs的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD大鼠20只，体重220～240 g，雌雄不限。提取和培养采用同种2月龄雄性大鼠1只。均由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。

1.2药物及试剂 中药饮片购自辽宁中医药大学附属第一医院，左归丸成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、牛膝9 g、龟板胶12 g，右归丸成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、当归9 g、肉桂6 g、杜仲9 g、附子6 g。将两种药方制备成水煎剂，生药量为1 g/ml。改良型 α-MEM培养液、胎牛血清(FBS)(Hyclone)；胰酶(Sigma)；抗碱性磷酸酶(ALP)抗体(博奥森)；抗-GAPDH 抗体(中杉金桥)；抗-TGF-β1、抗-Smad4抗体(Santa Cruz Biotechnology)。免疫组化及DAB试剂盒(博士德)。

1.3仪器 二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，BioSpec-nano型紫外可见分光光度计(岛津，日本)，WD-9413B凝胶成像分析仪(北京六一)；DFC320型倒置显微镜(Leica，德国)；BX53型显微镜(Olympus，日本)。

1.4方法

1.4.1含药血清制备与实验分组 将大鼠随机分为左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、补佳乐组(BJL)、空白对照组，雌雄各半，每组5只制备含药血清。……