王建杰 董 航 王茉琳 罗文哲 齐建祥

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

在前期的研究工作中，已经报道了丹皮酚对人乳腺癌细胞株(MCF-7)细胞具有抑制作用并诱导MCF-7细胞的凋亡〔1〕，本研究进一步地探讨丹皮酚对MCF-7细胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)mRNA表达的影响，阐明PI3K/Akt在丹皮酚诱导细胞凋亡过程中的意义，为丹皮酚治疗乳腺癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料 人MCF-7购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。RPMI 1640 培养液、Trizol来自Gibco公司，胎牛血清来源于Hyclone 公司。四甲基偶氮唑蓝( MTT)为北京拜尔迪生物技术公司产品。二甲基亚砜( DMSO) 为Sigma公司产品。Annexin-V异硫氰酸荧光素(FITC)试剂盒购于Beyotime 公司。反转录cDNA 合成试剂盒为大连TaKaRa 生物公司。

1.2细胞培养 细胞于9 cm 细胞培养皿中，加入10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次。实验于细胞处于对数生长期时进行。

1.3MTT法检测丹皮酚对MCF-7 细胞增殖活性的影响 细胞胰酶消化，调整细胞密度至5×104～1×105/ml，接种于96 孔培养板中，每孔100 μl，培养24 h，加入不同浓度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每个浓度设4 个平行孔，用RPMI1640 完全培养液作为对照，设空白调零，放于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h、48 h 后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h后，加入200 μl DMSO 溶液，于492 nm处测OD 值，计算细胞生长抑制率。细胞增殖抑制率(%) = (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色观察药物处理后细胞形态 5×104个/ml细胞接种于6孔板，每孔3 ml，24 h后，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚处理细胞，RPMI1640为阴性对照，培养48 h后，PBS清洗，每孔加入300 μl 4%甲醛固定液室温固定30 min，再加入100 μlAO与100 μl EB(终浓度均为10 μg/ml)混匀，4℃避光20 min，荧光显微镜下观察(激发波长545 nm)。……