郑 斌 刘 涛 郑永晨 李佳睿

(吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041)

Toll样受体9(TLR9)，是重要的模式识别受体，识别一组具有特定结构的寡核苷酸序列CpG，广泛地存在于病原体中。TLR9在识别病原体和激活天然免疫方面起着非常重要的作用〔1，2〕，激活的TLR9不但能够诱导天然免疫应答，并且对特异性免疫反应的发生有帮助。TLR9能够介导CpG对多种免疫细胞的激活，使细胞表面CD40、CD80、CD86等共刺激分子以及MHCⅡ类分子表达增加，而且促使细胞因子TNF-β、IFN-γ、IL2等的分泌，从而诱导Th1型免疫应答。TLR9参与CpG诱导的细胞活化及抑制其凋亡〔3～5〕。TLR9通过增加活化的DC细胞的生命，促进维稳Th1型应答。通过CpG与TLR9的作用，DC细胞等抗原提呈细胞能够交叉提呈外源性抗原，从而交叉激活CD8+细胞。TLR9是连接获得性免疫和天然免疫的桥梁〔6，7〕。

1 材料和方法

1.1材料 DMEM培养液和胎牛血清(Hyclone)，大肠杆菌JM109，肝癌细胞系SMMC7721(本室保存)；真核表达载体pcDNA3.0，Trizol试剂，G418(Invitrogen公司)λ-HindⅢ digest DNA Marker，T4 DNA连接酶，限制性内切酶(BamH I和EcoR I)，DNA片段回收/纯化试剂盒，Oligo(dT)18，dNTP；TA克隆试剂盒(大连宝生物);Taq DNA聚合酶和逆转录酶(Roch);小量质粒提取试剂盒，琼脂糖，引物合成，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，蛋白胨和酵母粉(OXOID)，DNA序列分析(上海生工生物公司)。MTT；兔抗人TLR9抗体和荧光素标记羊抗兔抗体(Bioss);引物序列：上游5′-AGCTGGATCCATGGGTTTCTGCCGCAGCGCCC-3′，带有BamH I酶切位点；下游 5′-AGCTGAATTCCTATTCGGCCGTGGGTCCC-3′带有EcoR I酶切位点。硫化寡核苷酸(ODN)2006S(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)，1826S(TCCATGACGTTCCTGACGTT)，2216S(GGGGGACGATCGTCGGGGG)，M362S(TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT)。低温台式离心机(德国Heraeus Stratos)；PCR仪(东胜公司)；二氧化碳培养箱(150i.Thermal);全波长分光光度仪( Thermal);倒置显微镜和倒置荧光显微镜(奥林巴斯)。核酸电泳设备和数码凝胶图像处理系统(Tanon公司)。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞RNA提取和人TLR9基因克隆 用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，用Trizol试剂提取外周血RNA；总RNA以Oligo(dT)18为引物，Roch长片段逆转录酶合成cDNA；用Roch长片段TaqDNA聚合酶和人TLR9上下游引物进行PCR扩增TLR9基因；扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。从琼脂糖电泳凝胶中回收DNA片段，回收片段与TA克隆载体连接和转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素的LB培养基上筛选阳性克隆；扩大培养阳性克隆菌，提取重组质粒(TA-TLR9)酶切和DNA序列分析鉴定。

1.2.2人TLR9基因亚克隆入pcDNA3.0真核表达载体 用内切酶BamH I和EcoR I分别双酶切pcDNA3.0和TA-TLR9质粒，凝胶电泳回收和纯化(TA-TLR9收集3 100 bp片段)；用T4 DNA连接酶连接；转化JM109，在含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒DNA(pcDNA-TLR9)，用内切酶和电泳鉴定。

1.2.3人TLR9重组质粒pcDNA-TLR9转染真核细胞 常规培养和传代SMMC7721细胞，细胞生长状态良好、融合度在75%时转染。采用磷酸钙方法转染细胞：pcDNA-TLR9 DNA 10 μg(218 μl)中加入32 μl氯化钙(2.0 mol)，混匀，缓慢加入250 μl 2倍的HBS缓冲液(HEPES 50 mmol;NaCl 280 mmol; Na2HPO450 mmol;NaH2PO450 mmol)混匀，静止30 min，形成白色沉淀颗粒。弃细胞培养液，将磷酸钙DNA液加入到培养细胞表面，37℃，5%CO2培养1 h，弃净液体，加入IMDM培养液(10%血清)，37℃，5%CO2培养，次日换液，48 h后换成含G418的培养液(500 μg/ml)，每3～5 d换液1次，直至大量细胞死亡后新克隆重新生长，再在G418选择压力下传代5次，建立稳定的SMMC7721-pcDNA-TLR9细胞系(SMMC7721-TLR9)。同时用空载体pcDNA3.0转染细胞作为对照(SMMC7721-pcDNA3.0)。

1.2.4SMMC7721-TLR9细胞系的鉴定 分别提取SMMC7721，SMMC7721-TLR9和SMMC7721-pcDNA3.0细胞系DNA，在琼脂糖凝胶上电泳，分别回收DNA条带，凝胶纯化试剂回收DNA，用PCR方法扩增人TLR9基因片段鉴定细胞DNA中人TLR9的重组。用兔抗人TLR9抗体和荧光标记羊抗兔抗体进行免疫染色鉴定人TLR9的表达，三组细胞同时进行检测，荧光显微镜下拍照。

1.2.5SMMC7721-TLR9细胞系对CpG的反应 分别培养SMMC7721，SMMC7721-TLR9和SMMC7721-pcDNA3.0细胞，按1.0×104细胞/ml分装于96孔培养板，每孔100 μl，37℃，5%CO2培养，细胞融合度达75%时加CpG：弃净培养液，用IMDM培养液稀释CpG，每个细胞系分别加入CpG 2006S，1826S，2216S和M362S终浓度为5.0 μg/ml，每孔100 μl，37℃，5%CO2培养48 h，弃净培养液，用无血清IMDM稀释MTT(0.5 mg/ml)，每孔加100 μl，37℃，5%CO2培养4 h，弃净培养液，用无血清IMDM洗2次，每孔加入二甲基亚砜100 μl，避光室温轻摇1 h溶解甲瓒，检测570 nm光密度，同时设置正常对照和空白对照，检测值减空白对照，并以试验孔的值比对照值的百分率表示细胞增殖率。

2 结 果

2.1TLR9基因片段的扩增 经1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增出大小约为3 100 bp的DNA片段(图1)。

2.2人TLR9-TA重组质粒鉴定 人TLR9-TA重组质粒全长3 099 bp，与GenBank序列对比(BLAST)，结果显示为人TLR9基因的全长开放读码框架。

2.3人TLR9基因亚克隆入pcDNA3.0真核表达载体 TLR9-TA载体亚克隆TLR9基因进入pcDNA3.0的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间，得到人TLR9基因pcDNA3.0重组质粒(pcDNA-TLR9)。

2.4pcDNA-TLR9转染SMMC7721细胞和鉴定 磷酸钙法将pcDNA-TLR9和pcDNA3.0分别转入SMMC7721细胞，经G418选择培养下得到阳性克隆，分别用PCR(图3，图4)和免疫荧光(图5)鉴定，仅有pcDNA-TLR9转染SMMC7721细胞DNA可以扩增出TLR9基因，转染pcDNA-TLR9的SMMC7721细胞质周边可见绿色荧光，其他两组细胞未见荧光。

图1 PCR产物电泳图

1：ΛDNA HindⅢ酶切标尺；2：pcDNA-TLR9 DNA酶切

1，2，3分别是SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721组DNA；4和5分别是DL-2000和ΛDNA HindⅢ酶切标尺

2.5SMMC7721-TLR9细胞系对CpG的反应 SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721细胞系分别用不同的CpG刺激，培养48 h，结果显示2006S对SMMC7721-TLR9细胞有刺激增殖作用。见图6。

1，2，3分别是SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721DNA PCR产物；4：DL-2000标尺

图5 pcDNA-TLR9的SMMC7721细胞免疫荧光检测结果

1：对照细胞；2：2006S；3：2216S；4：M362S；5：1826S

3 讨 论

在研究免疫佐剂和其作用机制时发现细菌DNA对哺乳动物免疫细胞具有激活作用，免疫激活通过TLR9介导，因此证明了细菌或病毒DNA是产生免疫活性的分子基础，也揭开了TLR9信号通路研究的序幕。经过10余年的研究，TLR9的组织表达、下游信号分子以及信号调控逐渐明晰〔1〕。TLR9主要分布在免疫细胞，目前认为TLRs与配体结合后有四种不同的衔接分子：MyD88、TIRAP/MAL、TRIF、TRAM〔2，3〕，含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)结构的寡核苷酸是TLR9的天然配体，具有一定结构的CpG分子即有免疫刺激作用。目前发现了大量的CpG分子具有不同功能活性的作用，包括用于刺激免疫细胞产生干扰素等细胞因子的CpG，新型CpG不断发现〔8～10〕，体现出具有广泛的应用前景。但是验证CpG活性的方法是利用动物或人外周血单个核细胞，在CpG的作用下表现增殖或抑制，每次试验的均质性和方便性受到影响，且不能大规模自动化筛选新型CpG。

本研究从人外周血单个核细胞中克隆出人TLR9全长cDNA，酶切和DNA序列分析证明为人TLR9基因完整的开放读码框架。将人TLR9基因重组入真核表达载体pcDNA3.0，制备出pcDNA3.0-TLR9重组质粒，将pcDNA3.0-TLR9重组质粒转入人肝癌细胞系SMMC7721，经G418选择筛选，得到携有pcDNA3.0-TLR9基因的SMMC7721细胞系SMMC7721-TLR9。

SMMC7721-TLR9细胞系表达TLR9蛋白，并在CpG的刺激下表现增殖反应。结果表明制备的SMMC7721-TLR9细胞系可以用于CpG研究，但是本文的结果显示SMMC7721-TLR9细胞系仅对2006S CpG增殖反应较强，对其他3种反应弱，可能的原因是MTT方法不是十分敏感，或者是实验条件没有达到最佳状态，需要进一步研究。

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