郑 斌 刘 涛 郑永晨 李佳睿

(吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041)

Toll样受体9(TLR9)，是重要的模式识别受体，识别一组具有特定结构的寡核苷酸序列CpG，广泛地存在于病原体中。TLR9在识别病原体和激活天然免疫方面起着非常重要的作用〔1，2〕，激活的TLR9不但能够诱导天然免疫应答，并且对特异性免疫反应的发生有帮助。TLR9能够介导CpG对多种免疫细胞的激活，使细胞表面CD40、CD80、CD86等共刺激分子以及MHCⅡ类分子表达增加，而且促使细胞因子TNF-β、IFN-γ、IL2等的分泌，从而诱导Th1型免疫应答。TLR9参与CpG诱导的细胞活化及抑制其凋亡〔3～5〕。TLR9通过增加活化的DC细胞的生命，促进维稳Th1型应答。通过CpG与TLR9的作用，DC细胞等抗原提呈细胞能够交叉提呈外源性抗原，从而交叉激活CD8+细胞。TLR9是连接获得性免疫和天然免疫的桥梁〔6，7〕。

1 材料和方法

1.1材料 DMEM培养液和胎牛血清(Hyclone)，大肠杆菌JM109，肝癌细胞系SMMC7721(本室保存)；真核表达载体pcDNA3.0，Trizol试剂，G418(Invitrogen公司)λ-HindⅢ digest DNA Marker，T4 DNA连接酶，限制性内切酶(BamH I和EcoR I)，DNA片段回收/纯化试剂盒，Oligo(dT)18，dNTP；TA克隆试剂盒(大连宝生物);Taq DNA聚合酶和逆转录酶(Roch);小量质粒提取试剂盒，琼脂糖，引物合成，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，蛋白胨和酵母粉(OXOID)，DNA序列分析(上海生工生物公司)。MTT；兔抗人TLR9抗体和荧光素标记羊抗兔抗体(Bioss);引物序列：上游5′-AGCTGGATCCATGGGTTTCTGCCGCAGCGCCC-3′，带有BamH I酶切位点；下游 5′-AGCTGAATTCCTATTCGGCCGTGGGTCCC-3′带有EcoR I酶切位点。硫化寡核苷酸(ODN)2006S(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)，1826S(TCCATGACGTTCCTGACGTT)，2216S(GGGGGACGATCGTCGGGGG)，M362S(TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT)。低温台式离心机(德国Heraeus Stratos)；PCR仪(东胜公司)；二氧化碳培养箱(150i.Thermal);全波长分光光度仪( Thermal);倒置显微镜和倒置荧光显微镜(奥林巴斯)。核酸电泳设备和数码凝胶图像处理系统(Tanon公司)。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞RNA提取和人TLR9基因克隆 用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，用Trizol试剂提取外周血RNA；……