李卫萍 李虹伟 顾复生

(首都医科大学附属北京友谊医院心血管中心，北京 100050)

单核细胞妊娠相关血(PAPP)-A与炎症密切相关，促进动脉粥样硬化不稳定斑块的形成，在急性冠脉综合征(ACS)的早期诊断、危险分层及预后评估方面有重要的临床应用价值〔1，2〕。前期研究提示炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α可在转录水平上呈剂量时间依赖性诱导人外周血单核细胞PAPP-A的基因表达，但具体细胞内信号调控机制尚不明确〔3〕。核转录因子(NF)-κB是一种多功能转录因子家族，广泛存在于人体各种组织和细胞中，能够调控多种细胞因子及炎症因子的基因转录及表达，在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。本研究探讨NF-κB是否参与TNF-α对人外周血单核细胞PAPP-A基因和蛋白表达的调控。

1 材料与方法

1.1主要试剂 重组TNF-α(rhTNF-α)(美国Peprotech公司)；BAY11-7082(美国Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中科院血液病研究所)；核蛋白提取及NF-κB p65检测试剂盒(美国Active Motif公司)；兔抗人PAPP-A抗体(美国Abcam公司)，膜蛋白提取试剂盒、兔抗β-actin抗体、羊抗兔二抗(北京尚柏生物医学技术有限公司)；胎牛血清、RPMI1640培养基、RNA酶抑制剂、dNTPs、Oligo(dT)15、M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)，SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司)；PCR引物(北京赛百盛公司)。

1.2方法

1.2.1外周血单核细胞的分离与培养 采集健康志愿者外周肘静脉血20 ml，肝素400 U抗凝，生理盐水1∶1稀释。用尖头吸管铺于比重1.077淋巴细胞分离液表面，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1。室温下2 500 r/min离心25 min，吸取中层单个核细胞，PBS洗涤两次后，将细胞重悬于RPMI1640。台盼蓝试验示活细胞率>95%。将细胞接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，用37℃预热的无血清RPMI 1640培养基清洗3次，将未贴壁细胞洗脱，经瑞氏染色鉴定贴附细胞为单核细胞，占85%。