柳 春 杨雪峰 张瑞鹏 赵丹玉 王艳杰

(辽宁中医药大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110032)

血管并发症是致2型糖尿病患者死亡的主要原因，而高频率的内皮细胞凋亡是血管病变发生的第一步〔1〕。苦荞麦总黄酮主要存在于苦荞麦花、叶、茎、籽粒中，具有抗氧化、抗衰老、改善血管微循环的作用〔2〕。软脂酸(PA)可致内皮细胞凋亡。本实验通过观察苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)凋亡模型的影响，探讨其抑制细胞凋亡的保护机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人脐静脉内皮细胞EA.hy926购自中国科学院上海细胞库，体外培养传代。DMEM/HIGH GLUCOSE培养基、胎牛血清购自HyClone公司；PA、二甲基亚砜购自Sigma公司、0.25%胰蛋白酶购自北京鼎国公司；RT-PCR 试剂盒、Trizol、琼脂糖购自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2抗体、羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组 细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基置于37℃，5% 二氧化碳(CO2)孵箱中培养,每2～3天换液，细胞长至亚融合后,用0.25%胰酶消化传代，实验用第3～4代细胞。细胞分为对照组(50 ng/L胰岛素),模型组(50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA)，苦荞麦总黄酮组(50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA+125 μg/ml)和二甲双胍组 (50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA+2 mmol/L二甲双胍) 。

1.2.2RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA表达 Trizol法提取总RNA并测定其含量。RT-PCR法对Bcl-2进行扩增，以β-actin 为内参。人β-actin 引物:上游引物：AggAgC AATgATCTTgATCTTCA-3′，下游引物:5′-ATCATgAAgTgTACgTggACAT-3′(扩增长度153 bp)。Bcl-2引物：上游引物：5′-TgggAgAACAgggTACgATA-3′，下游引物： 5′-CCACCgAACTCAAAgAAgg-3′(扩增长度453 bp)。Bcl-2 退火温度为56℃，β-actin 的退火温度为65℃。取扩增产物5 μl,用1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶图像分析系统进行对电泳结果进行分析，结果用Bcl-2 条带光密度值与内参β-actin条带光密度值的比值表示。……