李 娜 曲晓波 叶豆丹 李 晶 律广富 林 贺 杨 擎 常志达 张靖卓 李 斌 林 喆

(长春中医药大学研发中心药理实验室，吉林 长春 130117)

四妙勇安激发(SMYA)是治疗热毒性脱疽的经验良方，由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成，具有清热解毒、滋阴活血、通络功效。热毒性脱疽是古时候的主要适应证，和现代医学中的多种动脉狭窄或闭塞而导致的趾(指)脱落坏死性疾病相似，包括血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、糖尿病性坏疽等疾病〔1～3〕。本研究通过对SMYA对氧化损伤内皮细胞保护作用的研究，为进一步探讨其作用机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1细胞系 人脐静脉内皮细胞株ECV304(长春中医药大学研发中心)，用含10%胎牛血清1640培养基于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。

1.2药物、试剂与仪器 SMYA醇提物，由长春中医药大学研发中心实验室制备；血管紧张素转化酶(ACE)、内皮素(ET)、内皮型一氧化氮合酶(eNOs)酶联免疫检测试剂盒为美国BG公司产品；流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司。

1.3方法

1.3.1分组 取对数生长期的内皮细胞ECV304随机分成三组：空白组，用正常培养液培养；模型组，H2O2损伤，浓度为1 mmol/L，损伤4 h；SMYA组：先用H2O2损伤4 h后，50%EtOH提取物100 μg/ml培养24 h。

1.3.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力 消化后的细胞，5×104个/ml，200 μl接种于96孔板，培养24 h完全贴壁，按1.3.1分组，模型组和SMYA组先用H2O2(1 mmol/L，4 h)处理，弃上清，模型组用正常培养基培养，给药组用SMYA醇提物处理24 h，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亚矾(DMSO)使其显色，显色后振动孵育10 min，使结晶溶解完全，酶标仪490 nm测吸光度值(OD值)。

1.3.3SMYA醇提物对氧化损伤ECV304细胞周期的影响 取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后收集细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，4℃磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。……