孙雅彬 宋 鄂 郝继龙 叶 飞 张 泳 徐越超

(吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021)

眼内新生血管生成是糖尿病性视网膜病变(DR)病情发展的重要标志〔1〕。血管内皮生长(VEGF)及其受体在血管新生、血管分化及增加血管通透性等方面起重要作用〔2，3〕。然而，在 DR眼内新生血管生成中，调控VEGF蛋白质表达的确切机制尚不清楚。在高糖情况下，Müller细胞在病理性眼内新生血管生成中起到至关重要的作用〔4〕。应用XIAP抑制剂embelin研究高糖情况下XIAP对VEGF表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1化学药品 Embelin (Sigma公司，美国)，贮存原液浓度为50 mmol/L，溶解于DMSO (Sigma公司，美国)中，储存于-20℃备用。将emblin原液用培养液稀释至终浓度为0～60 μmol/L。无血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司，美国Fair Lawn))至终浓度为5，10，25,50 mmol/L。

1.2Müller 细胞培养 根据文献〔1〕的方法，分离并培养Sprague-Dawley (SD) 大鼠的视网膜Müller细胞。SD大鼠处死后立即摘除眼球，去除角膜、晶状体、玻璃体等非视网膜组织后，将视网膜切成 1 mm×1 mm大小的组织块，以30 μm 尼龙筛过滤后加入0.25% 胰蛋白酶，37℃孵育30 min。收集滤过物，500 r/min离心5 min。Müller 种植于 6 cm培养皿，培养液为含有20%胎牛血清的DMEM(100 μg/ml 链霉素，100 U/ml青霉素)，在 37℃，5% CO2培养箱内孵育。 24 h后更换培养液，却掉未贴壁的杂质细胞，Müller细胞在DMEM培养液中继续生长，每3日更换一次培养液。以0.25%的胰蛋白酶和EDTA 37℃消化并分离贴壁的Müller细胞，第三代细胞用于实验。Müller细胞的鉴定是透射电镜下见到细胞质内特异性的中间丝结构。

1.3Western印迹分析 Müller细胞在不同葡萄糖浓度(5，10，25，50 mmol/L)和(或)emblin(0，15，30,60 μmol/L)的培养液中孵育72 h后，冷PBS清洗2次。提取总蛋白，每孔20 μg 蛋白质样本10% SDS-PAGE电泳，然后转至尼龙膜上。膜与一抗共孵育，包括XIAP(1∶250，BD Biosciences公司，美国San Jose)和VEGF (1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology公司，美国)，4℃过夜。……