邓紫婷 周国庆 李荣亨 李 强 曾 丽

(重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

骨关节炎(OA)主要特征为关节软骨细胞的凋亡和细胞外基质的进行性降解〔1〕。蛋白聚糖酶属于带有血小板反应蛋白结构域单元的裂解素和金属蛋白酶(ADAMTs)家族。近年研究发现在OA早期，ADAMTS是降解蛋白多糖的主要酶系，比基质金属蛋白酶(MMPs)作用大约提前3 w左右，且抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5能有效防止关节软骨的破坏，其降解部位主要在蛋白多糖核心蛋白球间区域(IGD)的Glu373-Ala374作用位点〔2,3〕。复元胶囊是在长期临床实践的基础上总结出来的治疗OA的中药复方制剂，临床观察发现其对OA的疗效确切，不良反应少。前期研究显示，复元胶囊通过调节细胞因子、MMPs及其抑制剂(TIMPs)和生长因子之间的平衡〔4〕，抑制软骨中诱导性一氧化碳合酶(iNOS)的表达,减少NO的产生〔5〕，减少Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解〔6〕，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，从而发挥对OA的防治作用〔7〕。本文观察不同浓度复元胶囊对关节软骨中ADAMTS-4和ADAMTS-5表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 雄性8周龄SD大鼠60只，体重(200±10)g，由重庆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)2012-0001。复元胶囊：重庆希尔安药业公司生产(批准文号：渝卫2002〔42-33〕)，由黄芪、人参、川芎、丹参、淫羊藿、鹿角胶、肉苁蓉、骨碎补、枸杞子等中药组成，每粒0.41 g,每克粉末含生药3 g；抗骨增生胶囊：江苏康缘股份有限公司生产,生产批号：110402。ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗体，购于美国Santa Cruz公司；SABC试剂盒及DAB显色剂购于武汉博士德生物工程有限公司；软骨总提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒及2X Es Taq MasterMix(含染料)均来自于北京康为世纪；ADAMTS-4、ADAMTS-5及内参GAPDH引物由TakaRa公司合成(见表1)；SDS-PAGE凝胶试剂盒、RIPA蛋白提取试剂盒均由碧云天公司生产。BX50型光学显微镜来自日本OLYMPUS公司；DNA engine PT-200 PCR仪、BIO-RAD电泳仪及BIO-RAD凝胶成像仪来自美国BIORAD公司。

表1 引物序列情况

1.2方法

1.2．1分组及造模 将60只大鼠随机分为正常组，模型组，抗骨增生胶囊组，复元胶囊低、中、高剂量组，每组10只。Hulth法〔8〕建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下切断大鼠右膝关节内侧副韧带，完整切除内侧半月板及剪断前后交叉韧带逐层缝合，无菌包扎。术后给予肌注青霉素抗感染，共7 d。术后1 w开始每天驱赶大鼠跑步30 min，共驱赶4 w。正常组大鼠不给予任何处理。

1.2.2给药 依据Meeh-Rubner公式计算大鼠的等效给药剂量，复元胶囊低、中、高剂量组分别给予复元胶囊371.65、743.30、2 229.90 mg·kg-1·d-1,抗骨增生胶囊组给予抗骨增生胶囊557 mg·kg-1·d-1, 均配置成3 ml溶液，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，于术后第2周开始，每天灌胃1次，共4 w。

1.2.3光镜观察关节软骨细胞及基质 于治疗后第4周处死各组大鼠共60只，观察并记录关节囊、滑膜、关节软骨及关节液的一般情况，取胫骨平台全层软骨连同软骨下骨标本，将其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%EDTA脱钙15 d，常规石蜡包埋后切片，HE染色观察软骨组织结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankin法〔9〕评分标准进行评分，0级为正常;1级为表层破坏;2级为血管翳及表层破坏;3级为浅层裂隙形成;4级为局限性深达骨质的裂隙;5级为大面积深达骨质的软骨缺如;6级为负重区软骨全部丢失。

1.2.4免疫组化法检测关节软骨中蛋白聚糖酶1、2的蛋白表达 切片脱蜡至水，3%H2O2室温15 min灭活内源性过氧化物酶。冲洗后PBS浸泡5 min，胰蛋白酶消化液修复抗原活性20 min，正常山羊血清封闭，分别滴加1∶50的稀释抗大鼠ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜。PBS冲洗5 min，3次。滴加生物素标记的二抗(武汉博士德)，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min，3次。滴加SABC-HRP(武汉博士德)，37℃孵育30 min。PBS冲洗5 min，3次。DAB室温下显色至满意，自来水终止反应。苏木素复染3 min，洗去多余染液，盐酸酒精分化2 s，碳酸锂复染1 min，酒精梯度脱水后封片，显微镜下观察。图像分析：每个标本取5张切片，每张切片OLYMPUS BX50显微镜下放大200倍，随机取5个视野，采用Image-Pro Plus图像分析软件测定阳性染色平均累积光密度(IOD)。

1.2.5关节软骨总RNA提取和半定量RT-PCR检测ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表达 取损伤区软骨30 mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzol提取总RNA，紫外分光光度计检测样品吸光度(A)，A260/A280为1.8-2.0。每组取1 μl总RNA逆转录为cDNA(dNTP Mix,2.5 mmol/L Each 4 U、Primer Mix 2 μl、RNA Template 2 μl、5×RT Buffer 4 μl、DTT，0.1 mol/L、HiFi-MMLV,200 U/μl,1 μl、RNase-free Water 5 μl)。取cDNA 1 μl进行PCR扩增。扩增完毕后取5 μl产物于含50 μl/L GoldViewTM核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用BRO-RAD凝胶图像分析软件检测各组目的基因及内参的光密度值。

1.2.6Western印迹法检测软骨中ADAMTS-4和ADAMT-5的蛋白表达量 于-80℃中取出软骨组织，用RIPA试剂盒(碧云天公司)提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，按每孔50 μg上样，在10%的SDS-PAGE凝胶上电泳后，用湿法转膜法将蛋白转至0.45 μm孔径的PVDF膜上，用5%BSA在37℃条件下封闭2 h后，分别敷上抗ADAMTS-4、ADAMTS-5及抗β-actin的多克隆抗体(1∶50稀释)，在4℃过夜，用TBST洗3次，每次15 min。然后分别敷上羊抗兔及抗小鼠抗体，37℃ 条件下放置1 h后，用TBST冲洗3次，每次15 min。在暗室中敷上BeyoECL发光液，用ChemiDoc XRS凝胶/发光图像分析系统对蛋白条带进行显影，并采用Quantitiy One软件计算条带的灰度值。

2 结 果

2.1HE染色后观察软骨组织 正常组软骨组织4层结构清晰，软骨表层光滑平整，细胞排列整齐，基质染色均匀,潮线清晰Mankin评分为(0.33±0.08)分；模型组软骨组织层变薄，表层裂隙交错分布，细胞数目变少，排列紊乱，潮线严重断裂模糊Mankin评分为(6.9±0.30)分；抗骨增生胶囊组软骨表面欠光整，细胞层数增多，排列稍显紊乱，潮线部分断裂Mankin评分为(4.1±0.83分)；复元胶囊低剂量组软骨表层可见少许裂隙，细胞数减少，排列紊乱，有空泡样改变出现，潮线稍显紊乱Mankin评分为(5.6±0.48)分；复元中剂量组软骨组织染色较均匀，细胞层有增生且细胞数增多Mankin评分数为(4.3±0.45)分；复元高剂量组软骨组织表层尚且光滑平整，细胞有明显增生，中深层有少量细胞簇聚，可见双重潮线Mankin评分为(2.4±0.66)分。

2.2免疫组化法检测软骨组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达 正常组软骨在表层见少许阳性细胞；模型组及其余各组软骨组织见不同程度着色，软骨细胞的胞质中可见黄色颗粒着色，ADAMTS-4和ADAMTS-5均主要在胞质表达，以表层最为明显；复元胶囊中剂量组和高剂量组与模型组相比，ADAMTS的表达有明显减少，尤其以ADAMTS-5最为显著，且复元高剂量组减少程度显著(P<0.01)；与抗骨增生胶囊组比较，复元胶囊高剂量组ADAMTS-4及ADAMT-5表达低于抗骨增生胶囊组(P<0.01，P<0.05)。见表2，图1，图2。

表2 免疫化检测软骨组织中ADMAMTS-4、ADAMTS-5的表达(IOD，±s,n=10)

图1 各组鼠软骨组织中ADTS-4表达(DAB，×200)

图2 各组鼠软骨组织中ADAMTS-5表达(DAB，×200)

2.3RT-PCR法测定软骨组织中ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表达 各组软骨组织提取的RNA经逆转录和扩增后，电泳显示强弱不等的荧光(图3)。经图像软件分析结果显示，模型组ADAMTS-4及ADAMTS-5表达显著增加，与其余各组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；与抗骨增生胶囊组比，复元胶囊高剂量组ADAMTS-4和ADAMT-5的mRNA的表达量明显降低(P<0.05)，而复元胶囊低剂量组和中剂量组表达无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4Western 印迹法测定软骨组织中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表达 与正常组比较，模型组软骨组织中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表达量显著增高(P<0.01)；ADAMTS-4及ADAMTS-5在抗骨增生胶囊组和复元胶囊各组的蛋白表达量均较模型组显著降低(P<0.01)，复元胶囊低剂量组和中剂量组较之抗骨增生胶囊组差异不具有统计学意义(P>0.05)，复元胶囊高剂量组的表达量显著低于抗骨增生胶囊组(P<0.05)。见图4，表4。

表3 RT-PCR检测软骨组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA表达(目的/GAPDH,±s，n=10)

表4 蛋白印迹检测软骨组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白表达(目的/β-ACTIN,±s，n=10)

1.正常组;2.模型组;3.抗骨增生胶囊组;4.复元胶囊低剂量组;5.复元胶囊中剂量组;6.复元胶囊高剂量组

1.正常组;2.模型组;3.抗骨增生胶囊组;4.复元胶囊低剂量组;5.复元胶囊中剂量组;6.复元胶囊高剂量组

3 讨 论

在OA病变早期，以细胞外基质的降解为主，基质主要由胶原和蛋白多糖构成，其中蛋白多糖占关节软骨基质干重的40%，以软骨聚集蛋白多糖的形式存在〔10〕。在体外实验中发现，只有蛋白多糖降解后Ⅱ型胶原才缓慢降解。MMPs和蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5是主要的蛋白聚糖酶〔11〕，ADAMTS-4与ADAMTS-5结构相似，均具有前肽区、催化区、解聚素样区、血小板凝血酶敏感蛋白样序列1区(TSP-1)、半胱氨酸富含区及间隔区，其中ADAMTS-5还有一个血小板凝血酶敏感蛋白样序列2区(TSP-2)，TSP区可与ECM结合，参与蛋白多糖的降解。蛋白聚糖酶可在多个位点裂解蛋白多糖，一是核心蛋白G2-G3的硫酸软骨素富集区的4个位点；二是传统球间区G1-G2(IGD)的作用位点。Glasson等〔12〕在敲除的ADAMTS-5和ADAMTS-4基因的小鼠实验中发现，在炎性和非炎性骨关节炎中，敲除ADAMTS-5基因可减少对小鼠软骨组织中的蛋白多糖的降解，而敲除ADAMTS-4无此作用。Stanton等〔13〕通过在小鼠体内和体外实验中证明去除ADAMTS-5活性能对抗蛋白多糖的降解。随着基因敲除及转基因技术的引入，蛋白聚糖酶对OA病程中蛋白多糖的降解作用得到进一步确定，因此西医做出大量的努力用来研发聚蛋白聚糖酶的小分子抑制剂〔14〕，在治疗骨关节炎上寻找突破，而在中医对OA的治疗方面的研究才刚刚起步。

中医认为骨关节炎属于“骨痹”范畴。其病因病机为：气血不足，肝肾亏虚，风寒湿侵入骨髓，痹阻经络导致筋骨失养，证属肝肾亏虚、气滞血瘀，治法以补肾壮骨，益气活血为主。复元胶囊中人参、黄芪益气活血，具有抗疲劳、抗缺氧、增强机体适应能力的作用；川芎、丹参行气活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循环的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨关节炎。鹿茸、淫羊藿补肾壮阳、强筋健骨，有调节免疫和促性腺激素样作用，而研究发现性激素通过促进软骨细胞中生长因子的表达，抑制多种炎症因子的表达 ，影响细胞外基质的合成和降解，达到延缓OA的病程进展的作用〔15〕。

本实验结果显示，复元胶囊能够通过抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的产生，减少蛋白多糖的降解，从而减轻关节软骨的损伤，延缓0A的发展进程。

4 参考文献

1Kuettner KE，Goldberg VM.In：Kuettner KE，Goldberg VM.Osteoarthritis disorders〔M〕.Rosement：American Academy of Orthopaedic Surgeons，1995;pp xxi-xxv.

2Tortorella MD, Burn TC, Pratta MA, Abbaszade I,etal.Purification and cloning of aggrecanase-1: a member of the ADAMTS family of proteins.〔J〕 Science,1999;284(5420):1664-6.

3Hurskainen TL, Hirohata S, Seldin MF,etal.ADAM-TS-5, ADAM-TS6, and ADAM-TS7,novel members of a new family of zinc metalloproteases.General features and genomic distribution of the ADAM-TS family〔J〕.J Biol Chem, 1999; 274(36):25555-63.

4曾 丽，李荣亨，钟 玉，等.复元胶囊对膝骨关节炎模型Ⅱ型胶原羧基端肽、基质金属蛋白酶-13的影响〔J〕．中国老年学杂志,2011;31(20):3969-73.

5肖彩芝，李荣亨，曾 丽,等.复元胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨iNOS及血清PGE2、NO的影响〔J〕.中国老年学杂志, 2010;30(9):1580-3.

6肖彩芝，李荣亨，曾 丽，等.复元胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的影响〔J〕.中成药,2011;33(5):770-4.

7周小莉，李荣亨.复元胶囊对硝普钠诱导的软骨细胞凋亡与细胞周期作用的实验研究〔J〕.中国药房,2010;11(39):3661-5.

8Hulth JN，Barrach HJ，Chichester CO．Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis〔J〕．Osteoarthr Cartil，1999;7(6):539-47．

9Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L，etal.Biochemical and metabolic ab-normalities in articular cartilage from osteoarthritis human hips〔J〕.J Bone Joint Surg Am，1971;53(3):523-37.

10Naito K，Watari T，Furuhata A，etal．Evaluation of the effect of glucosamine on an expermental rat osteoarthritis model[J]．Life Sci，2010;86(13-14):538-43．

11Priyanka Verma, Krishna Dalal.ADAMTS-4 and ADAMTS-5:key enzymes in osteoarthritis〔J〕.J Cellular Biochem,2011;112(12):3507-14.

12Glasson SS, Askew R, Sheppard B,etal.Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilagedegradation in a murine model of osteoarthritis〔J〕.Nature, 2005; 434(7033):644-8.

13Stanton H, Rogerson FM, East CJ,etal.ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilagein vivo and in vitro〔J〕.Nature, 2005; 434(7033):648-52.

14De Savi C,Pape A, Sawyer Y,etal.Orally active achiral Nhydroxyformamide inhibitors of ADAM-TS4 (aggrecanase-1) and ADAM-TS5(aggrecanase-2) for the treatment of osteoarthritis〔J〕.Bioorg Med Chem Lett,2011;21(11):3301-6.

15黄家谷,夏 春.雌激素与骨关节炎〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(24):3844-7.