陈文龙 曹文富 何 英 高世娇

(重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

肝纤维化是肝组织对慢性、反复性损伤的修复反应，是多种类型细胞、氧化应激、细胞因子和生长因子等共同参与的一系列复杂作用的结果，以细胞外基质(ECM)成分的过度增生与异常沉积为主要特征〔1〕。无论何种原因引起的慢性肝脏损伤都涉及肝纤维化过程〔2〕。目前单纯西医治疗肝纤维化手段有限。我们的前期研究发现，益气、化瘀、化痰、养阴法中药煎剂可以降低肝组织内纤维化程度，且以益气、化瘀、化痰、养阴四法合用作用最强〔3〕。近年来，有越来越多的研究表明，肝纤维化发生机制与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)密切相关〔4〕。因此，本研究拟在既往研究的基础上，进一步观察不同剂量益气化瘀化痰养阴方药对肝纤维化大鼠肝组织结构及PPARγ表达的影响。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器 本试验所需中药饮片均购自于重庆桐君阁大药房，秋水仙碱由云南植物药业公司生产；PPARγ一抗、二抗及Western印迹试剂盒均购自于北京中杉公司，Trizol总RNA提取试剂、逆转录试剂盒、扩增试剂均由Takara公司生产，普通PCR仪、凝胶成像仪为BIO-RAD公司，紫外公光光度仪为Beckman公司，H-7500型电镜为日本日立公司生产。

1.2肝纤维化造模方法 参考文献〔5〕方法，大鼠皮下注射CCl4溶液，首剂量为5.0 ml/kg体重，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4橄榄油溶液(剂量0.3 ml/100 g)，持续4 w。造模开始2 w给予高脂、低蛋白质复合饲料(猪油20%+胆固醇0.5%+玉米粉79.5%)，2 w后改用普通饲料，6 w造模期间用10%白酒作为唯一饮料。

1.3动物分组 雄性SD大鼠110只，体重180～220 g，购自重庆医科大学实验动物中心〔许可证号：SYXK(渝)2007-0001〕，于重庆医科大学SPF级动物实验室饲养，动物自由进食进水。实验室采用12 h自动光暗交替，相对湿度55%，温度(23±2)℃。动物在适应性喂养1 w后进行实验。将大鼠随机分为正常组、肝纤维化模型组、秋水仙碱组、益气化瘀化痰养阴低剂量组、中剂量组及高剂量组。除正常组外，其余各组均制备肝纤维化模型，造模结束后随机取2只大鼠行HE染色进行验证。

1.4动物处理 (1)正常组及肝纤维化模型组灌服生理盐水(3 ml/100 g，1次/d)；(2)秋水仙碱组给予秋水仙碱水溶液灌胃(0.01 mg/100 g，1次/d)；(3)益气化瘀化痰养阴低、中、高剂量组分别给予1、2、4 g/ml煎剂(3 ml/100 g，1次/d)。12 w后处死大鼠。

1.5中药制备 精选黄芪、白术、川芎、姜黄、半夏、海藻、白芍、鳖甲(药物比例2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2)，混合水提并浓缩成益气化瘀化痰养阴中药煎剂，低、中、高剂量中药煎剂每毫升分别含生药1、2、4 g。

1.6标本采集与处理 最后一次用药后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于冰盒上处死大鼠，摘取肝脏，取部分肝组织分别用10%甲醛和4%戊二醛固定，待做HE染色及电镜检查，其余标本于液氮中冷冻后再转移到-70℃冰箱中保存。

1.7观察指标

1.7.1光镜观察 肝组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片、HE染色及Masson染色，光镜观察肝组织病理结构，采用METAVIR评分系统〔6〕把肝纤维化分为4级。

1.7.2电镜观察 活体大鼠麻醉后取下1 mm3肝组织，立即放入4℃ 4%戊二醛溶液中固定2 h，0.1 mmol/L PBS液清洗3次，4℃ 1%四氧化锇溶液中固定2 h，常规乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂浸透、包埋、聚合，制备0.5 μm厚度半薄切片，在光镜下定位后再制备60 nm厚度超薄切片，再经醋酸铀、枸椽酸铅染色，H-7500型电镜观察。

1.7.3RT-PCR法检测肝组织PPARγ mRNA表达 根据试剂说明书，提取大鼠肝组织总RNA，紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，42℃ 20 min条件下逆转录为cDNA。PPARγ正义：5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，反义：5′-TTCAATCGGATGGTTCTTCG-3′，目的片段为319 bp，退火温度53.8℃。内参GAPDH正义：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′，反义：5′-GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT-3′，产物长度610 bp，退火温度58.5℃。PCR反应条件预变性94℃ 3 min；94℃ 30 s，53.8℃(内参为58.5℃)30 s，72℃ 45 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后取PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，并将凝胶置于凝胶成像仪上用Quantityone 4.6图像分析软件进行照相分析。各条带的相对光密度值=目的条带光密度值/内参GAPDH条带光密度值。

1.7.4Western印迹法检测肝组织PPARγ蛋白表达 称取一定量的肝脏组织，加入10倍体积的组织裂解液匀浆，冰浴30 min后，4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清，BCA试剂盒蛋白定量，组织总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性。30 g蛋白经15%SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜(Millipore)，3%BSA室温封闭2 h，加入一抗4℃过夜，TBS-Tween洗膜后加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，加入ECL发光液，经EC检测系统检测各组PPARγ蛋白表达。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 实验过程中，大鼠死亡率约为26.3%，仅正常组大鼠无死亡，各组大鼠存活率无明显差异。正常组大鼠体重明显增加，体格健壮，反应灵敏，毛发有光泽；模型组大鼠瘦弱，反应迟钝，毛发干枯无光泽，部分毛发打结，食欲差，腹部略显饱满，其余各治疗组均较模型组有不同程度好转。

2.2不同剂量益气化瘀化痰养阴法中药对肝组织病理形态的影响

2.2.1光镜观察 (1)HE染色及Masson染色：正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞呈多边形，无变性、坏死，有1～2个圆形细胞核，核仁明显，核内染色质稀疏，染色较浅，胞质丰富；模型组可见肝纤维化间隔伴小叶结构紊乱，肝细胞内大量大小不等空泡，细胞核被挤压到细胞边缘，并可见大量炎性细胞浸润，且以汇管区最明显；秋水仙碱组肝细胞内空泡较模型组明显减少；益气化瘀化痰养阴中药中、高剂量组肝组织形态基本正常，仅于汇管区有少量炎性细胞浸润，而益气化瘀化痰养阴中药低剂量组与模型组形态较接近。见图1。(2)肝纤维化程度：各组之间纤维化程度差异具有统计学意义(F=39.539,P=0.00)。肝纤维化程度顺序为：模型组>中药低剂量组>秋水仙碱组>中药中剂量组>中药高剂量>正常组。其中，中药低剂量与模型组差别无统计学意义(P=0.162)，与中药中、高剂量组相比具有显著差异(P=0.00)，中药中剂量与高剂量差别无统计学意义(P=0.688)。见表1。

Ⅰ:正常组；Ⅱ:模型组；Ⅲ:秋水仙碱组；Ⅳ:中药低剂量组；Ⅴ:中药中剂量组；Ⅵ:中药高剂量组；下图同

表1各组大鼠肝纤维化METAVIR评分比较(n)

组别nMETAVIR评分0级 1级 2级 3级 4级平均Ridit值正常组101000000.175模型组11001820.8561)秋水仙碱组15156300.5941)2)中药低剂量组13014710.7681)中药中剂量组15852000.3321)2)中药高剂量组16961000.3101)2)合计802817141830.5001)2)

2.2.2电镜观察 正常组肝细胞形态正常，细胞间紧密连接，内质网、线粒体及核蛋白体丰富，毛细胆管微绒毛丰富，形态正常；模型组及中药低剂量组可见肝纤细内大量脂滴，细胞核基本正常，线粒体、内质网等细胞器肿胀且数量明显减少，糖原稀疏，并可见较多成纤维细胞及少量淋巴细胞浸润，周围可见大量纤维沉积；秋水仙碱组、中药中剂量及高剂量组形态与正常组形态相似。见图2。

(×15 000) (×10 000) (×10 000)

(×12 000) (×10 000) (×15 000)

2.3不同剂量益气化瘀化痰养阴法中药对肝组织PPARγ的影响

2.3.1肝组织PPARγ mRNA表达 模型组〔(42.46±8.00)%〕及中药低剂量组〔(42.45±7.09)%〕肝组织PPARγ mRNA含量低于正常组〔(59.03±9.64)%〕，而中药中、高剂量组〔(65.86±5.97)%、(66.54±7.33)%〕高于正常组。对肝组织PPARγ mRNA相对浓度进行方差分析(F=30.75,P<0.01)，显示模型组、各治疗组肝组织PPARγ mRNA与正常组比较差异显著(P<0.05)，且以模型组和中药低剂量组降低最明显(P=0.00)；与模型组相比，中药低剂量组〔(51.88±5.66)%〕PPARγ mRNA无明显升高(P=0.99)，而秋水仙碱〔(51.88±5.66)%〕以及中药中、高剂量组明显升高，以中药中、高剂量升高最明显(P=0.00)，中药中剂量与高剂量组之间无明显差异(P=0.792)。见图3A。

2.3.2不同剂量益气化瘀化痰养阴中药对肝组织PPARγ蛋白表达的影响 各组大鼠肝组织PPARγ蛋白表达情况与肝组织内PPARγ mRNA水平基本一致(F=21.34,P<0.01)。肝纤维化模型组中PPARγ蛋白表达最少(0.28±0.09)，其次为中药低剂量组(0.31±0.06)，且这两组之间差异无统计学意义(P=0.50)；中药中剂量与高剂量组肝组织PPARγ蛋白含量(0.53±0.10、0.54±0.10)接近正常组(P=0.59，0.73)，中药中剂量及高剂量组也无明显差异(P=0.84)。正常组及秋水仙碱组分别为0.55±0.10，0.43±0.090，见图3B。

图3 肝组织PPARγ mRNA、蛋白含量

3 讨 论

肝纤维化的形成是一个复杂的动态过程，是诸多慢性肝病向肝硬化发展的主要中间环节，早期有效地控制并逆转肝纤维化进程对阻止肝硬化具有重要意义。然而，目前尚无切实有效的肝纤维化治疗方案〔7〕。

近年来，PPARγ及其配体在肝纤维化中的作用越来越受到重视。许多研究表明，PPARγ及其配体参与了肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞(MFB)转变的TGF-β信号通路、肝生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血小板源性生长因子(PDGF)信号通路及瘦素、脂联素等细胞内信号转导等多信号通路〔4，8〕。在这些通路中，PPARγ的表达、活化与HSC的活化、增殖，ECM沉积、降解以及肝纤维化的发展密切相关。

我们在研究中发现，中、高剂量益气化瘀化痰养阴中药可提高肝纤维化模型大鼠肝组织内PPARγ mRNA水平，PPARγ蛋白较正常组有增高趋势，但组间比较无统计学意义，两者变化不一致。出现上述表现的原因，我们推测一方面可能是外源性配体竞争性抑制内源性配体，使PPARγ蛋白结构发生改变〔9〕，导致PPARγ蛋白表达相对减少；另一方面可能是肝纤维化时，脂质过氧化和以TNF-α为主的炎性介质释放皆可激活ERK信号通路，由ERK通路介导的磷酸化反应能通过对PPARγ的磷酸化降低PPARγ转录活性〔10〕。但具体原因有待进一步研究。

虽然传统中医并无“肝纤维化”这一概念，但历代医家对其证候、病因病机、防治措施等早有论述，主要散在于“黄疸”、“胁痛”、“积聚”、“鼓胀”等疾病。2006年，中国中西医结合学会肝病专业委员会制定了《肝纤维化中西医结合诊疗指南》，将肝纤维化证候归纳为气阴虚损和瘀血组络2个基本证型以及肝胆湿热、肝郁脾虚、肝肾阴虚3个常见证型〔11〕。临床发现痰浊壅滞也是肝纤维化的常见证型〔12〕。我们认为肝纤维化基本病机特点为本虚标实，本虚主要是指气虚与阴虚，标实主要是指瘀血及痰浊。“气虚与阴虚并见，痰凝与瘀血互结”既然为肝纤维化的基本病机，就可按益气化瘀化痰养阴法立法论治。

本研究选用益气药(黄芪、白术)、活血化瘀药(川芎、姜黄)、化痰药(半夏、海藻)、养阴药(白芍、鳖甲)，其中黄芪具有益气健脾、升阳举陷、益卫固表、利水消肿的功效，是临床上最常用的益气药物之一；白术能益气健脾、燥湿利水，与黄芪配伍使用，能增强益气健脾、利湿之功；川芎能活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛，为“血中之气药”；姜黄“主心腹结积，下气，破血，消痈肿”(出自《新修本草》)。半夏燥湿化痰，消痞散结，为化痰要药；海藻能消痰散结软坚，利水消肿；白芍养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗，是最常见的养阴柔肝药之一；鳖甲滋阴潜阳，软坚散结。益气药黄芪、白术与化痰药半夏、海藻配伍，能协同发挥益气健脾、化痰散结作用；与化瘀药川芎、姜黄配伍，共同显示益气化瘀化痰功效；再与养阴药白芍、鳖甲配伍共凑养气养阴、柔肝散结之功效。一是通过益气养阴法扶助正气，使津气血津液能正常运行，从而杜绝痰浊与瘀血的生成；二是以化瘀化痰法促进已成之“痰浊与瘀血”消散化除，使处于痰浊凝聚与痰瘀互结病理进程的肝组织结构及功能复原的目的。诸多国内研究已表明以上八味中药可以有效抑制或者调节参与各种器官纤维化中的关键因子，如TGF-β1、TIMP-1、 MMPs等〔13～15〕。而对PPARγ等较新的、在纤维化过程中也发挥着重要作用的指标研究甚少。

本文结果显示，中高剂量益气化瘀化痰养阴法中药能增加肝组织内PPARγ mRNA和蛋白表达，对肝纤维大鼠具有治疗作用，而低剂量治疗效果不明显。这可能是因为益气化瘀化痰养阴法中药的治疗效果呈剂量-效应关系，低剂量中药不足以增强肝组织内PPARγ mRNA和蛋白表达。然而，本研究目前仅设立了三个剂量组，且无血药浓度监测，缺乏益气化瘀化痰养阴法中药抗肝纤维化剂量-效应关系方面的具体数据。

4 参考文献

1Parsons CJ,Takashima M,Rippe RA.Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2007；22(s1):S79-S84.

2Wallace K,Burt AD,Wright MC.Liver fibrosis〔J〕.Biochem J,2008；411(1):1-18.

3李 艳，曹文富.益气化瘀化痰养阴法单剂与合剂对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1受体表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2013；33(3):601-4.

4Zhang F,Lu Y,Zheng S.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma cross-regulation of signaling events implicated in liver fibrogenesis〔J〕.Cell Signal,2012；24(3):596-605.

5马学惠.肝纤维化动物模型的造模方法〔J〕.中华肝脏病杂志,1996；4(1):58-60.

6Bedossa P.Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis C〔J〕.Hepatology,1994；20(1):15-20.

7李 才.器官纤维化：基础与临床〔M〕.北京：人民卫生出版社,2003：79-107.

8Braunersreuther V,Viviani GL,Mach F,etal.Role of cytokines and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease〔J〕.World J Gastroenterol,2012；18(8):727-35.

9Olefsky JM.Treatment of insulin resistance with peroxisome proliferator-activated receptor γ agonists〔J〕.J Clin Invest,2000；106(4):467-72.

10He G,Sung YM,Fischer SM.Troglitazone induction of COX-2 expression is dependent on ERK activation in keratinocytes〔J〕.Prostaglandins,Leukotrienes Essential Fatty Acids,2006；74(3):193-7.

11中国中西医结合学会肝病专业委员会.肝纤维化中西医结合诊疗指南〔J〕.中国中西医结合杂志,2006；26(11):1052-6.

12张广业，徐光福.肝硬化从痰瘀论治〔J〕.中国中医基础医学杂志,2011；31(12):1316-7.

13李 艳，曹文富.益气化瘀化痰养阴方剂对肝纤维化大鼠TGF-β1表达的影响〔J〕.中成药,2012；30(8):1437-42.

14孙妩弋，魏 伟，桂双英，等.芍芪多苷抗大鼠免疫性肝纤维化作用及部分机制〔J〕.中国药理学通报,2010；26(4):492-7.

15艾志波，张荣华，闫国和，等.鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化的作用及其机制研究〔J〕.第三军医大学学报,2011；33(3):274-7.