张 剑 吴 敏 张自森 王利娟 张红巧 师广勇 巴 楠 闫 琳 郑晓珂 邢 鑫

(郑州大学第五附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052)

直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，是大肠癌的最常见部分，我国直肠癌的发病率和死亡率均明显升高。SLP-2基因属于stomatin基因家族成员，是2001年发现的一个新基因〔1〕，近年来的研究显示，SLP-2在多种恶性肿瘤中过表达，可能是一个新的肿瘤相关基因〔2～6〕。本研究拟分析SLP-2蛋白的表达水平及与临床病理资料的关系，旨在探讨SLP-2在直肠癌中的表达特点及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1临床资料 直肠癌组织及距离癌组织边缘>5 cm的癌旁正常直肠组织为郑州大学第五附属医院2010年1月至2011年1月手术切除直肠癌标本40例，其中男21例，女19例，年龄48～76岁，中位年龄63岁。所有标本均经病理学检查确诊为直肠癌，术前未接受过放、化疗。临床分期按TNM分期标准(AJCC 2010年第7版)。

1.2RT-PCR SLP-2扩增片段长度500 bp，正义5′-CTGGAGCCTGGTTTGAACAT-3′；反义5′-AGGATCTGGGCCTGTTTCTT-3′。内参β-actin扩增片段长度242 bp，正义5′- ACACTGTGCCCATCTACGACC-3′；反义5′-AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，SLP-2及内参上、下游引物各 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O补至25 μl。PCR反应：预变性：94℃，5 min，变性94℃，30 s，退火55℃，30 s，延伸72℃，50 s，30个循环，延伸72℃，7 min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条带图像凝胶成像仪扫描，以SLP-2与β-actin的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相对表达水平。

1.3免疫组化 鼠抗人SLP-2单克隆抗体稀释度为1∶200，购自美国proteintech公司。免疫组化试剂盒购自迈新公司。用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。操作步骤按试剂盒说明书进行。结果判定标准参照文献〔7〕，由两位高年资病理医师在双盲条件下进行评分，每张切片根据阳性细胞百分数及阳性细胞染色程度进行评分。细胞膜及细胞质染色程度评分由每张切片的大多数细胞染色情况决定，0分：无着色，1分：浅黄色，2分：黄色，3分：棕黄色。阳性细胞百分数评分：0分：没有阳性细胞，1分：1%～25%阳性，2分：26%～50%阳性，3分：51%～75%阳性，4分：>75%阳性。两者分数相乘为总分，≥8分为高表达，<8分为阴性或低表达。

1.4统计学分析 应用SPSS16.0软件行χ2或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1SLP-2 mRNA在直肠癌及癌旁正常直肠黏膜中的表达 正常直肠组织SLP-2 mRNA表达水平为0.66±0.12，直肠癌组织SLP-2 mRNA表达水平为1.35±0.27，二者比较差异有统计学意义(F=7.076，P=0.019)，见图1。

图1 直肠癌(C)及癌旁正常组织(N)中SLP-2 mRNA的表达

2.2SLP-2蛋白在直肠癌及癌旁正常直肠黏膜中的表达 SLP-2在直肠癌组织中多呈高表达，在癌旁正常直肠黏膜中多为阴性或低表达。SLP-2在直肠癌和癌旁正常直肠黏膜中的高表达率分别为67.5%(27/40)和22.5%(9/40)，差异有统计学意义(χ2= 16.364，P=0.000)，见图2。

2.3SLP-2蛋白表达与直肠癌临床病理特征之间的关系 见表1。

表1 SLP-2的表达与直肠癌临床病理参数的关系(n)

3 讨 论

SLP-2基因是2000年首次发现并命名的一个新基因，近年来的研究显示，SLP-2在多种恶性肿瘤中呈高表达，可能是一个新的恶性肿瘤相关基因。但目前有关SLP-2在直肠癌中的表达情况及对直肠癌影响的研究较少。本研究采用免疫组化法及RT-PCR法发现SLP-2在直肠癌组织中表达升高，并通过分析直肠癌患者的临床病理资料，发现在较晚期、有淋巴结转移的病例中SLP-2表达升高更为明显。提示SLP-2可能是一个与直肠癌分期和转移相关的指标，在直肠癌的发展和转移中起一定的促进作用。

SLP-2是一种细胞质膜相关蛋白，与细胞脂阀结构密切相关，并存在于细胞线粒体中，参与调解线粒体的能量代谢〔1，7～10〕。由于脂筏内有多种细胞信号传导分子，可参与许多细胞信号传导通路，而线粒体的能量代谢可直接影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等特性，因此推测，SLP-2可能通过调节细胞信号传导通路及细胞能量代谢参与肿瘤的发生发展。Horiuchi等〔11〕的研究发现，SLP-2可能通过与Rho家族蛋白的相互作用，调节细胞信号传导通路，参与卵巢癌的侵袭转移。祁代华等〔12〕的实验显示，结直肠癌组织中SLP-2与Rho家族的CDC42蛋白表达呈正相关。Cao等〔13〕的研究发现，SLP-2可能通过激活MAPK / ERK信号通路促进食管癌的侵袭和转移。Wang等〔7〕的研究报道，SLP-2可能通过调节细胞线粒体膜电势和ATP水平，影响食管癌的运动及增殖。Hájek等〔9〕报道，转染SLP-2 siRNA下调Hela细胞的SLP-2表达后，Hela细胞线粒体膜电势降低。目前SLP-2在恶性肿瘤中的作用机制尚未完全阐明，有待进一步深入探索。

本研究发现SLP-2在直肠癌组织中呈高表达，并与直肠癌的淋巴结转移和TNM分期相关。恶性肿瘤的分期及是否有淋巴结转移和远处转移是决定其预后的重要因素，因此，SLP-2可能作为直肠癌的一个有意义的预后指标，指导直肠癌患者的预后生存，并有可能作为一个新的肿瘤靶向治疗的靶点。

4 参考文献

1Wang Y，Morrow JS.Identification and characterization of human SLP-2，a novelhomo- logue of stomatin ( band 7.2b ) present inerythrocytes and other tissues〔J〕.J Biol Chem，2000；275(117)：8062-71.

2Chang D，Ma K，Gong M，etal.SLP-2 overexpression is associated with tumor distant metastasis and poor prognosis in pulmonary squamous cell carcinoma〔J〕.Biomarkers，2010;15(1)：104-10.

3张 剑，李建生，吴 敏，等.SLP-2在胃癌组织中的表达及对胃腺癌细胞SGC7901运动侵袭的影响〔J〕.中华消化杂志，2013;33(1)：37-41.

4冯旺琴，崔竹梅，冯凤芝，等.SLP-2 mRNA在子宫内膜癌中的表达及其意义〔J〕.中华妇产科杂志，2005;40(4)：553-7.

5Cao W，Zhang B，Li J，etal.SLP-2 overexpression could serve as a prognostic factor in node positive and HER2 negative breast cancer〔J〕.Pathology,2011;43(7)：713-8.

6Liu D，Zhang L，Shen Z，etal.Increased levels of SLP-2 correlate with poor prognosis in gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer,2013;16(4)：498-504.

7Wang YQ，Cao WF，Yu ZC，etal.Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility，proliferation and enhances cell sensitivity to Chemo- therapeutic reagents〔J〕.Cancer Biol Ther，2009;17(151)：1651-8.

8Sprenger RR，Speijer D，Back JW，etal.Comparative proteomics of human endothelial cell caveolae and rafts using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2004;25(1)：156-72.

9Hjek P，Chomyn A，Attardi G.Identification of a novel mitochondrial complex containing mitofusin 2 and stomatin-like protein 2〔J〕.J Biol Chem，2007;282(8)：5670- 81.

10Christie DA，Lemke CD，Elias IM，etal.Stomatin-like protein 2 binds cardiolipin and regulates mitochondrial biogenesis and function〔J〕.Mol Cell Biol,2011;31(18)：3845-56.

11Horiuchi A，Imai T，Wang C，etal.Up-regulation of small GTPases，RhoA and RhoC，is associated with tumor progression in ovarian carcinoma〔J〕.Lab Invest，2003;83(7)：861-70.

12祁代华，李建生，王康康.SLP-2和CDC42蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义〔J〕.中华消化杂志，2009;29(2)：191-2.

13Cao W，Zhang B，Ding F，etal.Expression of SLP-2 was associated with invasion of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS One,2013;8(5)：e63890.