陈凤萍，吴 霖，沈 岩，许 琪

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京100005

精神分裂症是一种病因尚未完全阐明的复杂疾病，人群中的终生患病率为 1%［1-2］，遗传度约为81%［3］。目前已发现了许多相关基因，例如:乙醛脱氢酶2基因 (aldehyde dehydrogenase 2 gene，ALDH2)、儿茶酚-O-甲基转移酶基因 (catechol-O-methyltransferase gene，COMT)、多巴胺D4受体基因 (dopamine receptor D4 gene，DRD4)等［4］。精神分裂症的发生有多种假说［5］，其中多巴胺假说被广泛接受［6］。胆囊收缩素 (cholecystokinin，CCK)广泛存在于中枢及外周神经系统［7］，一般与多巴胺同时存在，调节其释放及其相关行为［8］。胆囊收缩素受体A基因 (cholecystokinin A receptor gene，CCKAR)是 CCK的 A型受体［9］。CCKAR基因位于4p15.2-15.1，表达胆囊收缩素受体A。Wei等［10］研究发现，位于 CCKAR基因中的rs1800857位点可能与精神分裂症相关，并多次被证实［11-12］。通过持续研究，多个位点被证实与精神分裂症相关，如:rs1800908、rs1799723等［13］。本研究通过对CCKAR基因进行深度测序，寻找了CCKAR基因中其他与精神分裂症相关的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)位点或罕见变异位点。

对象和方法

对象及分组2008年12月至2009年2月在东北招募的精神分裂症患者8例 (病例组)和正常对照者8名 (对照组)。病例组8例患者中，男5例，女3例，平均年龄 (37.6±2.9)岁 (27～46岁)，均经过2名副主任以上医师采用精神障碍诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of Mental DisordersⅣ，DSM-Ⅳ)检查确诊入院。同时应用DSM-Ⅳ定式临床会谈量表 (Structured Clinical Interview for DSM-Ⅳ，SCID)作为标准化临床诊断工具。实施诊断的医师经过严格培训并在实验前进行诊断一致性检验，保证了入组对象的同质性。对照组8名受试者中，男3名，女5名，平均年龄 (34.6±4.9)岁 (24～54岁)，均招募自当地社区，排除有精神或神经系统疾病家族史的个体。所有实验样本均来自北方汉族人群，获得中国医学科学院北京协和医学院伦理委员会批准，均签署知情同意书。

DNA提取基因组DNA主要由酚-氯仿抽提方法或采用DNA提取试剂盒 ［Flexi Gene DNA Kit(250)，美国QIAGEN公司］从个体的全血中提取，从1 ml全血中提取DNA之后将DNA样本储存至4℃。

CCKAR基因区域捕获测序采用Haloplex目标富集系统 (美国Agilent公司)对包括CCKAR基因(chr4:26483018-26492042)在内的一段区域 (chr4:26470000-26500000)的DNA序列进行捕获测序。捕获的步骤如下:(1)采用限制性内切酶降解基因组DNA;(2)已降解的DNA与Haloplex探针在目标区域上杂交;(3)捕获目的DNA;(4)结束捕获，环化片段;(5)准备PCR预混液;(6)用NaOH洗脱捕获到的DNA;(7)PCR扩增目的文库;(8)纯化扩增到的目的文库;(9)验证富集物及量化富集到的目的DNA;(10)用不同的指标对样本进行组合分析。

统计学处理采用IGV软件查看测序结果，去除结果中的假阳性位点 (仅处在片断边缘的突变位点即为假阳性)，以免影响后期的分析。对确定为阳性的位点采用Unphased 2.0软件进行分析，获得OR值，分析测序得到的阳性位点是否与精神分裂症相关。

结 果

通过测序 CCKAR基因获得的插入/缺失位点(in/del)为 16个 (13.68%)，SNP位点为 75个(64.10%)，新发现的未知位点 (即不存在于NCBI数据库中的位点，暂命名为None)为10(8.55%)。对该区域深度测序，芯片覆盖度约为94.26%，平均测序深度达115.09。

采用IGV2.3软件查看测序结果，去除测序得到的117个位点中的14个 (11.96%)假阳性位点，这些假阳性位点均为None位点。去除假阳性位点后，在该区域内所检测到的位点，有30个位于CCKAR基因上，包括:5个 (4.27%)插入/缺失位点、22个(18.80%)SNP位点和3个 (2.56%)None位点。

采用Unphased软件分析检测到的位于CCKAR基因的SNP位点，结果发现1个较有意义的位点——rs191275118，该位点在病例组样本中出现的次数是2，在对照组样本中的出现次数为0(表1)。根据NCBI的SNP数据库显示，rs191275118位于CCKAR基因第3内含子，主等位基因为A，次等位基因为G，其次等位基因频率 (minor allele frequency，MAF)值为0.002。在CCKAR基因中检测到的3个未在NCBI数据库中出现的变异位点为 chr4:26485259、chr4:26487139、chr4:26488302，其在病例组样本中出现的次数均为0，在对照组样本中出现的次数均为1，OR值为0。

表1 SNPs discovered from deep sequencing in CCKAR gene regionTable 1 通过深度测序在CCKAR基因内发现的SNP位点

讨 论

精神分裂症是典型的多基因复杂疾病，由遗传因素和环境因素共同作用［14］。其中，遗传因素发挥着重要的作用。目前已报道的有关精神分裂症的关联研究有1727项，可能的易感基因1008个，多态性位点8788个，以及287个荟萃分析报道 (截止到2014年2月28日，http://www.schizophreniaforum.org/res/sczgene/default.asp)。CCKAR基因是这其中一个重要的与精神分裂症相关的基因。近几年来对CCKAR基因的研究很多，但是结果复杂多样，且重复性较差。

遗传异质性是精神分裂症遗传学研究中一个重要的干扰因素，也是众多复杂疾病研究的障碍之一，往往使复杂疾病的研究变得比较困难。本研究希望能够通过对CCKAR基因的深度测序，寻找精神分裂症发病中与CCKAR相关的变异位点，从而确定可能是由于某一位点的影响或是这些位点共同作用导致了与CCKAR相关的精神分裂症的发生。结果发现1个可能与精神分裂症相关的变异位点——rs191275118，位于CCKAR基因的第3内含子。rs191275118的MAF值为0.002，属于罕见变异位点 (一般认为，MAF＜1%的变异位点为罕见变异［15］)。目前还几乎没有发现关于CCKAR基因中rs191275118位点的报道，提示rs191275118可能是一个新发现的CCKAR基因中与精神分裂症的相关位点。同时，因为这一位点是一个低频突变位点，可能会对“常见疾病-罕见变异 (common-disease rare variation，CDRV)”的假说起到部分支持作用。本研究属于对CCKAR基因及该位点的初步研究，从实验结果看来，该位点具有一定的研究意义，值得深入研究。可以利用大样本对这个位点进行验证，证实rs191275118与精神分裂症的相关性。

本研究中未发现该区域中与精神分裂症相关的未知变异位点。但是，并不证明在CCKAR基因中不存在与精神分裂症相关的未知变异。推测原因可能是这些位点的频率过低或信号较小不容易被检测到;或是由于二代测序中芯片的覆盖度不能达到100%，一些突变位点未能被检测到，这有待于技术层面的提升。

综上，本研究虽然仍存在一些缺陷，但发现了CCKAR基因中可能与精神分裂症相关的新的变异位点，若其他研究中对这一位点进行后续的研究及分析，可能会发现更多的信息，对CCKAR基因的相关资料具有补充作用。

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