朱飞云，刘卫红，王小晓，崔 琳，沈 思，朱明军，王幼平河南中医学院第一附属医院中心实验室及心脏中心，郑州450000

2河南中医学院中西医结合临床学科，郑州450008

除糖尿病外，高血压是导致终末期肾脏病的主要疾病之一［1］。研究证实，以单核/巨噬细胞浸润为主的炎症反应在盐敏感性高血压所致的肾脏损害中发挥着重要作用［2］。在病理状态下，白细胞中的单核细胞与其相应的趋化因子相互作用促使其渗出并向炎症部位聚集，构成慢性炎症反应的主要病理变化。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)属于C-C趋化因子家族，与单核/巨噬细胞表面的C-C趋化因子受体2(C-C chemokine receptor 2，CCR2)相互作用，可诱发以单核/巨噬细胞浸润为主的炎症反应［3］。研究证实，使用CCR2阻断剂可明显抑制糖尿病等多种疾病引起的肾脏损害［4-5］。瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)受体是一种非选择性阳离子通道，可被多种刺激所激活，如高温 (＞42℃)、低pH值和辣椒素等［6］。表达TRPV1受体的末梢感觉神经纤维广泛分布于血管外膜及肾脏。当TRPV1受体被激活后，可导致末梢感觉神经纤维释放降钙素基因相关肽和P物质，造成血管扩张［6］。笔者以往研究发现，由醋酸脱氧皮质酮 (deoxycorticosterone acetate，DOCA)和盐诱发的盐敏感性高血压在TRPV1基因敲除 (TRPV1-/-)小鼠中可造成明显的肾脏损害，同时伴有大量单核/巨噬细胞浸润［2］，提示在盐敏感性高血压过程中，TRPV1基因缺陷所介导的肾脏损害与单核/巨噬细胞的浸润密切相关，但其具体分子生物学机制尚不明确。本研究采用TRPV1-/-小鼠，观察了在盐敏感性高血压过程中CCR2阻断剂对TRPV1基因缺陷所介导的肾脏功能和形态学损害的影响，以期阐明TRPV1受体和CCR2在盐敏感性高血压所诱导的肾脏损害中的相互作用。

材料和方法

实验动物及试剂清洁级雄性C57BL/6小鼠 (周龄8～9周)为野生型小鼠 ［北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0011］，TRPV1-/-小鼠 (南京大学模式动物研究所)与C57BL/6小鼠回交至少6代以上所产雄性TRPV1-/-小鼠 (周龄8～9周)用于本实验。CCR2阻断剂RS504393(美国Tocris Bioscience公司)，DOCA片 (美国 Innovative Research of America公司)，ELISA尿白蛋白试剂盒(美国 Exocell公司)，改良的 Jaffe肌酐测定试剂盒(美国BioAssay System公司)，尿8-异构前列腺素试剂盒 (美国Cayman Chemical公司)，大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体 (1∶400，英国Serotec公司)和大鼠IgG(1∶400，美国 Vector Laboratories公司)。

造模及分组野生型及TRPV1-/-小鼠共为74只，分别分为假手术组 (野生型假手术组组和TRPV1-/-假手术组，n均=7)、DOCA-盐高血压组 (野生型DOCA-盐高血压组和TRPV1-/-DOCA-盐高血压组，n均=8)和DOCA-盐高血压-RS504393组 (野生型DOCA-盐高血压-RS504393组和TRPV1-/-DOCA-盐高血压-RS504393组，n均=8)。根据本实验室建立的实验方法建立DOCA-盐高血压小鼠模型［7］。具体如下:经皮下注射混合麻醉剂［氯氨酮 (80 mg/kg)+甲苯噻嗪(4 mg/kg)］，常规切除左侧肾脏，于小鼠颈部皮下植入DOCA片，术后给予含1%NaCl和0.2%KCl的饮用水，持续4周。假手术组小鼠仅摘除左侧肾脏，但不植入DOCA片，给予正常饮用水。DOCA-盐高血压组给予皮下注射RS504393的溶媒;DOCA-盐高血压-RS504393组给予特异性的CCR2阻断剂RS504393，RS504393溶于含有5%二甲基亚砜的生理盐水，皮下注射，2 mg/kg，每日2次，持续4周。预实验结果显示，与无任何处理的假手术小鼠比较，接受RS504393溶媒或RS504393处理的野生型或TRPV1-/-假手术小鼠血流动力学、肾脏功能和肾脏形态学指标差异均无统计学意义 (P均＞0.05)，因此该部分数据由无任何处理的假手术组代表。术后所有小鼠连续3 d肌肉注射青霉素钠盐。观察4周。

动脉收缩压测定分别于术前及术后各周，根据Tail-cuff体积描记法原理，利用BP-2000型血压测定仪 (美国Visitech System公司)测定清醒小鼠尾动脉收缩压。测定时间为上午10∶00～12∶00。小鼠在30℃电毯上安静加热10 min后，固定器固定，待小鼠稳定后连续测定尾动脉收缩压5次，取其平均值。

尿样及血浆分析于术后第26天，将小鼠放入代谢笼，适应1 d后收集24 h尿液，称体重。于术后第28天皮下注射混合麻醉剂麻醉小鼠，经腹主动脉采血，在4℃条件下离心10 min(4000×g)，取血浆保存于-80℃。尿白蛋白用ELISA试剂盒测定，尿及血浆中肌酐浓度用改良的Jaffe肌酐测定试剂盒测定，尿8-异构前列腺素用特异性试剂盒测定。

肾脏病理组织学分析摘除右肾，称重，置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。对石蜡包埋组织切片 (厚度4 μm)进行过碘酸-雪夫 (periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson三色染色。由1位不了解实验情况的病理学研究人员，根据笔者已发表的方法［7］，分析评估肾小球硬化和肾小管间质损伤程度，根据肾小球硬化范围、肾小管间质损伤及炎症细胞浸润程度进行半定量分析。

免疫组织化学染色分析采用卵白素-生物素复合物技术对单核/巨噬细胞标记物F4/80进行染色。常规处理石蜡包埋组织切片后，加入大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，4℃下孵育12 h，冲洗，然后加入生物素标记的抗大鼠IgG，室温下孵育1 h后加卵白素-生物素复合物，室温孵育45 min，加入fast red显色液(美国Vector Laboratories公司)，显微镜下观察控制染色。采用正常大鼠血清或去除第一抗体的方法作为阴性对照。根据笔者发表的方法［7］，每张切片随机选取15个高倍视野 (×400)计数F4/80阳性细胞，取其平均值。

统计学处理采用Prism 5.0统计软件，所有实验数据以均数±标准差表示，组间血压差异比较采用两因素方差分析 (Two-way ANOVA和Bonferroni检验)，多组间差异采用单因素方差分析 (One-way ANOVA和Bonferroni检验)，均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组小鼠血压各组术前基础血压差异无统计学意义 (P＞0.05)。术后野生型假手术组和TRPV1-/-假手术组小鼠血压平稳，而术后第1周其余各组小鼠血压与相应的假手术组比较均明显升高 (P均＜0.05)，并且于术后第3、4周达高峰。DOCA-盐高血压组和DOCA-盐高血压-RS504393组的血压差异无统计学意义 (P＞0.05)，并且各组内野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠的血压差异无统计学意义 (P＞0.05)(图1)。

尿白蛋白排泄量及肌酐清除率各组小鼠体重差异无统计学意义 (P＞0.05)(表1)。与相应的假手术组比较，野生型 DOCA-盐高血压组和 TRPV1-/-DOCA-盐高血压组的肾脏重量 (mg/10 g体重)和24 h尿白蛋白排泄量均显著增加 (P均＜0.05)，而肌酐清除率显著下降 (P＜0.05)。与相应的DOCA-盐高血压组比较，RS504393处理组的24 h尿白蛋白排泄量显著降低而肌酐清除率显著升高 (P均＜0.05)。

尿8-异构前列腺素排泄量与相应的假手术组比较，野生型DOCA-盐高血压组和TRPV1-/-DOCA-盐高血压组的24 h尿8-异构前列腺素排泄量均显著增加(P＜0.05)，并且TRPV1-/-DOCA-盐高血压组的排泄量显著高于野生型DOCA-盐高血压组 (P＜0.05)(图2)。与相应的DOCA-盐高血压组相比较，RS504393处理组的24 h尿8-异构前列腺素排泄量明显降低(P＜0.05)。

图1 各组小鼠收缩压比较Fig 1 Comparison of systolic blood pressure of mice in different groups

表1 各组小鼠体重及肾脏相关参数的变化 (x±s)Table 1 Body weights and renal parameters in mice in different groups(x±s)

肾脏病理组织学野生型DOCA-盐高血压组小鼠可见明显肾小球硬化，其肾小球硬化指数显著高于相应的假手术组 (P＜0.05)，且TRPV1-/-DOCA-盐高血压组的肾小球硬化指数显著高于野生型DOCA-盐高血压组 (P＜0.05)(图3、4)。RS504393处理组的肾小球硬化指数均显著低于相应的 DOCA-盐高血压组(P＜0.05)。野生型DOCA-盐高血压组小鼠的肾小管间质损伤程度显著高于假手术组，主要表现为肾小管上皮细胞萎缩和管腔扩张及炎性细胞浸润等 (图5、6)，TRPV1-/-DOCA-盐高血压组的肾小管间质损伤程度显著高于野生型DOCA-盐高血压组。RS504393处理的小鼠肾小管间质损伤程度显著低于相应的DOCA-盐高血压组 (P＜0.05)。

图2 各组小鼠尿8-异构前列腺素24 h排泄量Fig 2 24 h urinary excretion of 8-isoprostane in mice in different groups

图3 各组小鼠肾脏组织PAS染色 (×400)Fig 3 Periodic acid-Schiff stain of mice renal tissues in different groups(×400)

图4 各组肾小球硬化指数变化Fig 4 Indexes of glomerulosclerosis in different groups

图5 各组小鼠肾脏组织Masson染色 (×200)Fig 5 Masson’s stain of mice renal tissues in different groups(×200)

免疫组织化学染色与假手术组比较，F4/80阳性的单核/巨噬细胞浸润数量在野生型和 TRPV1-/-DOCA-盐高血压组肾脏中显著增加 (P＜0.05)，且TRPV1-/-DOCA-盐高血压组肾脏中的浸润数量显著高于野生型DOCA-盐高血压组 (P＜0.05)(图7、8)。RS504393处理的小鼠F4/80阳性单核/巨噬细胞浸润数量显著低于相应的DOCA-盐高血压组 (P＜0.05)。

图6 各组小鼠肾小管间质损伤分数Fig 6 Scores of renal tubulointerstitial injury in different groups

图7 各组小鼠肾脏F4/80阳性单核/巨噬细胞免疫组织化学染色 (×400)Fig 7 F4/80-positive monocytes/macrophages in mice renal tissues in different groups as indicated by immunohistochemical stain(×400)

图8 各组小鼠肾脏F4/80阳性单核/巨噬细胞数量变化Fig 8 Comparison of numbers of F4/80-positive monocytes/macrophages in mice renal tissues in different groups

讨 论

本研究显示，通过皮下包埋DOCA和饮用盐水所诱发的盐敏感性高血压在野生型小鼠中可造成肾脏损害，主要表现为尿白蛋白增加、肌酐清除率下降、尿8-异构前列腺素排泄增加、肾小球硬化和肾小管间质损伤，其中肾小管间质损伤包括肾小管上皮细胞萎缩、管腔扩张及肾间质单核/巨噬细胞浸润等，以上肾脏损害的表现在TRPV1-/-小鼠中更为严重。在野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠中，盐敏感性高血压所诱导的肾脏功能及形态学损害均被CCR2阻断剂RS504393所抑制，且该作用在TRPV1-/-小鼠中更为突出。该结果提示CCR2介导盐敏感性高血压所诱导的肾脏损害，其机制可能是通过CCR2介导的单核/巨噬细胞浸润。

在高血压的发生发展过程中，血压升高是造成肾脏损害的主要机制之一［8］。本研究结果显示，野生型和TRPV1-/-DOCA-盐高血压组小鼠的血压差异无统计学意义。CCR2阻断剂不影响皮下包埋DOCA和饮用盐水所诱发的盐敏感性高血压，但可抑制和改善盐敏感性高血压造成的肾脏功能及形态学损害，并且该作用在TRPV1-/-小鼠中显著增强。据此，笔者推测在野生型和TRPV1基因敲除小鼠CCR2阻断剂对盐敏感性高血压所诱导的肾脏损害的保护作用可能主要是通过影响CCR2介导的信号转导通路而非影响血压。

研究表明，高血压所诱导的肾脏损害往往与单核/巨噬细胞浸润为主的炎症反应有关［2，9-10］。血中的白细胞，包括单核细胞，在其渗出、移动和分化过程中涉及到多种环节和因素，在此过程中趋化因子发挥重要作用。在各种趋化因子中，MCP-1与单核/巨噬细胞表面的CCR2相互作用促使单核/巨噬细胞渗出、移动和分化，从而形成以单核/巨噬细胞浸润为主的炎症反应［3］。高盐饮食可激活TRPV1受体，并且在盐敏感性高血压过程中，TRPV1基因缺陷进一步加重该过程所诱发的肾脏损害，同时伴随有大量的单核/巨噬细胞浸润［2，11］，提示TRPV1受体可能通过抑制单核/巨噬细胞功能而缓解盐敏感性高血压所诱导的肾脏损害。本研究发现CCR2阻断剂可抑制盐敏感性高血压造成的肾脏损害及单核/巨噬细胞浸润，且该保护作用在TRPV1-/-小鼠中尤为明显，提示TRPV1受体可能通过抑制CCR2而减少单核/巨噬细胞的浸润，从而实现其肾脏保护作用。

传统生理学认为，TRPV1受体主要表达于感觉神经纤维，包括C类和Aδ感觉神经纤维，该类感觉神经纤维广泛分布于心血管及肾脏系统，并参与对心血管及肾脏功能的调节［6］。近期研究发现，除感觉神经纤维外，TRPV1受体亦广泛存在于血管内皮细胞，激活后可通过腺苷酸活化蛋白激酶信号通路激活内皮型一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，从而增加一氧化氮产生［12-13］。此外，研究发现在盐敏感性高血压动物模型中，激活TRPV1受体可减少氧自由基的产生，其机制可能与激活eNOS产生一氧化氮有关［14］。Ali等［15］利用分子生物学方法证实，改善eNOS功能可减少活性氧的产生，从而抑制MCP-1/CCR2信号通路。根据上述研究结果，笔者推测TRPV1受体抑制MCP-1/CCR2信号通路的机制可能与调节eNOS功能、减少活性氧的产生有关。本研究结果也显示，TRPV1基因敲除小鼠给予DOCA和盐水后尿中的氧化应激产物 (即8-异构前列腺素)显著增加，但是，激活的TRPV1受体抑制MCP-1/CCR2信号通路的机制有待进一步研究阐明。

综上，本研究发现CCR2诱导的以单核/巨噬细胞浸润为主的炎症反应在盐敏感性高血压造成的肾脏损害中发挥着重要作用。CCR2阻断剂通过抑制单核/巨噬细胞的浸润及氧化应激反应，实现其在盐敏感性高血压过程中的肾脏保护作用。临床上通过药理学方法阻断CCR2介导的信号转导通路可能成为防治盐敏感性高血压所致肾脏损害的方法之一。TRPV1可通过抑制CCR2介导的单核/巨噬细胞浸润减少盐敏感性高血压所诱导的肾脏损害。因此，在临床上有可能通过调节TRPV1受体功能防治高血压，尤其是盐敏感性高血压，所诱发的终末期肾脏损害。

［1］Atkins RC.The epidemiology of chronic kidney disease［J］.Kidney Int Suppl，2005，(94):S14-S18.

［2］Wang Y，Wang DH.Aggravated renal inflammatory responses in TRPV1 gene knockout mice subjected to DOCA-salt hypertension ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(6):F1550-F1559.

［3］Niu J，Kolattukudy PE.Role of MCP-1 in cardiovascular disease:molecular mechanisms and clinical implications［J］.Clin Sci(Lond)，2009，117(3):95-109.

［4］Urushihara M，Ohashi N，Miyata K，et al.Addition of angiotensinⅡtype 1 receptor blocker to CCR2 antagonist markedly attenuates crescentic glomerulonephritis［J］.Hypertension，2011，57(3):586-593.

［5］Sayyed SG，Ryu M，Kulkarni OP，et al.An orally active chemokine receptor CCR2 antagonist prevents glomerulosclerosis and renal failure in type 2 diabetes ［J］.Kidney Int，2011，80(1):68-78.

［6］Julius D，Basbaum AI.Molecular mechanisms of nociception［J］.Nature，2001，413(6852):203-210.

［7］Wang Y，Wang DH.Role of substance P in renal injury during DOCA-salt hypertension［J］.Endocrinology，2012，153(12):5972-5979.

［8］Polichnowski AJ，Lu L，Cowley AW Jr.Renal injury in angiotensin II+L-NAME-induced hypertensive rats is independent of elevated blood pressure ［J］.Am J Physiol，2011，300(4):F1008-F1016.

［9］Rhaleb NE，Pokharel S，Sharma U，et al.Renal protective effects of N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive mice［J］.J Hypertens，2011，29(2):330-338.

［10］Rodríguez-Iturbe B，Vaziri ND，Herrera-Acosta J，et al.Oxidative stress，renal infiltration of immune cells，and saltsensitive hypertension:all for one and one for all［J］.Am J Physiol，2004，286(4):F606-F616.

［11］Wang Y，Babánková D，Huang J，et al.Deletion of transient receptor potential vanilloid type 1 receptors exaggerates renal damage in deoxycorticosterone acetate-salt hypertension［J］.Hypertension，2008，52(2):264-270.

［12］Poblete IM，Orliac ML，Briones R，et al.Anandamide elicits an acute release of nitric oxide through endothelial TRPV1 receptor activation in the rat arterial mesenteric bed［J］.J Physiol，2005，568(Pt 2):539-551.

［13］Ching LC，Chen CY，Su KH，et al.Implication of AMP-activated protein kinase in transient receptor potential vanilloid type 1-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase［J/OL］ .Mol Med，2012，doi:10.2119/molmed.2011.00461［2013-12-01］.http://static.smallworldlabs.com/molmedcommunity/content/pdfstore/11_461_ching.pdf.

［14］Hao X，Chen J，Luo Z，et al.TRPV1 activation prevents high-salt diet-induced nocturnal hypertension in mice［J］.Pflugers Arch，2011，461(3):345-353.

［15］Ali ZA，Bursill CA，Douglas G，et al.CCR2-mediated antiinflammatory effects of endothelial tetrahydrobiopterin inhibit vascular injury-induced accelerated atherosclerosis［J］.Circulation，2008，118(14 Suppl):S71-S77.