孟庆彬，于健春，康维明，马志强，周 立，叶 欣，曹战江，田树波中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院基本外科，北京00730

2武汉市第一医院胃肠外科，武汉430022

胃癌是中国第2位常见的肿瘤相关死亡原因［1］，侵袭特性导致胃癌患者预后较差，阐明胃癌侵袭转移的分子机制对于胃癌治疗具有重要意义。真核翻译起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2，EIF5A2)作为可能的癌基因在卵巢癌［2-3］、膀胱癌［4］、肺癌［5］、肝癌［6］、结直肠癌［7-8］、胰腺癌［9］及黑色素瘤［10］等多种人类肿瘤中表达异常升高并通过多种途径诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞迁移及侵袭［11］。基因组筛查发现，EIF5A2在预测胃癌淋巴结转移方面可能发挥重要作用［12］，但EIF5A2在胃癌细胞增殖和迁移侵袭过程中的作用机制鲜有报道。本研究采用小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)转染MKN28细胞，评估了抑制EIF5A2对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其可能的分子机制。

材料和方法

材料及试剂MKN28、HGC27人胃癌细胞由北京协和医院基本外科实验室保存。永生化正常胃黏膜上皮细胞 (immortalized gastric mucosal epithelial cells，GES-1)购自北京康为世纪生物科技有限公司。胃癌及匹配的非癌正常胃黏膜新鲜组织由2例于北京协和医院接受胃癌根治术的胃中-低分化腺癌患者获得，并获得患者知情同意及北京协和医院伦理委员会授权。BCA蛋白浓度检测试剂盒和ECL发光剂购自美国Thermo公司，细胞计数试剂盒 (cell counting kit-8，CCK-8)购自日本Dojindo公司，RPMI-1640及胎牛血清购自美国Gibco公司，EIF5A2、C-myc兔单克隆抗体购自美国Epitomics公司，E-cadherin、vimentin、Cyclin D1、转移相关蛋白-1(metastasis-associated protein 1，MTA1)兔单克隆抗体及Cyclin D3鼠单克隆抗体购自美国CST公司，GAPDH兔多克隆抗体购自美国Santa cruz公司，山羊抗鼠和抗兔抗体购自中杉金桥生物技术有限公司;引物、siRNA、Lipofectamine 2000转染试剂、超纯RNA提取试剂盒，M-MLV逆转录合成试剂盒购自美国Invitrogen公司;Matrigel基质胶购自美国BD公司;PVDF膜购自Amersham Biosciences公司。

siRNA的设计及合成3对EIF5A2 siRNA及对照siRNA均由美国Invitrogen公司设计合成，其序列分别为:(1)siRNA#1:正义链 5’-GCUUCCAGCACUUAC CCUATT-3’，反义链 5’-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3’;(2)siRNA#2:正义链5’-GGUUCACCUUGUUGGAA UUTT-3’，反义链 5’-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3’;(3)siRNA#3正义链5’-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3’，反义链 5’-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3’;(4)对照 siRNA:正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反义链 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

细胞培养及siRNA转染用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞 (MKN28、HGC27及GES-1)并接种在培养瓶内，置于37℃、5%CO2、95%湿度的孵箱内培养。实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)法及 Western blot法检测 EIF5A2表达水平，选取EIF5A2高表达细胞株进行后续实验。转染前24 h接种胃癌细胞于6孔板内，每孔接种4×105个细胞，24 h后约长满60%进行转染实验。设置siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3、阴性对照siRNA转染组以及空白对照组(H2O代替siRNA)，每孔siRNA与脂质体Lipofectamine 2000的比例为100 pmol∶5 μl，转染6 h后更换细胞培养基;24 h后提取总RNA，48 h后提取总蛋白;转染24 h后进行细胞增殖、迁移及侵袭实验。

CCK-8法检测细胞增殖设EIF5A2 siRNA转染组和对照siRNA转染组。转染siRNA至6孔板MKN28细胞，每组3个重复孔;孵育24 h后消化计数细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，取100 μl接种于96孔板内孵育;分别于贴壁后0、24、48、72 h每孔加入10 μl CCK-8，细胞培养箱内孵育1.5 h;酶标仪上用450 nm波长测定吸光度，计算实验组和对照组之间吸光度值的差异。

Transwell法检测细胞迁移及侵袭能力细胞迁移能力检测:实验分组如上，每组3个重复孔;转染24 h后，消化重悬细胞，调节细胞浓度为2.5×105/ml;于Transwell板下室内加入500 μl含20%血清完全培养基，上室加入200 μl细胞悬液，培养24 h后弃去陈旧培养基，用棉签轻轻拭去上室内未迁移细胞;甲醇固定，苏木素伊红染色;倒置显微镜下观察，选5个代表区域，200倍镜下计数，取均值。细胞侵袭能力检测:Matrigel胶预先包被Transwell板上室基底膜，细胞铺板前水化基底膜;细胞接种浓度5×105/ml，余方法同细胞迁移实验。

qRT-PCR法检测RNA干扰对EIF5A2表达的影响siRNA转染24 h后收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA。反转录合成EIF5A2 cDNA(EIF5A2引物序列:正义链:5’-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3’，反义链:5’-GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3’)。采用荧光定量PCR仪进行 qRT-PCR，主要程序:95℃10 min;95℃ 15 s，40个循环;60℃ 1 min。每个样本设3个副孔。GAPDH mRNA作为内参对照 (引物序列:正义链:5’-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反义链:5’-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3’)。

Western blot法检测RNA干扰对EIF5A2及可能靶蛋白表达的影响 siRNA转染48 h后收集细胞提蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每孔60 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭;洗膜，一抗孵育 (兔抗人EIF5A2单抗，兔抗人GAPDH多抗，均1∶1000稀释)，4℃冰箱中摇床上过夜;次日洗膜，二抗室温孵育1 h(HRP标记的山羊抗兔或抗鼠二抗，1∶3000稀释);洗膜，行辣根过氧化物酶化学发光增强剂显色反应，显像。

统计学处理采用SPSS 12.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，计量资料组间比较如满足方差齐则采用双侧Studentt检验，不满足方差齐性检验的数据比较则采用Satterthwaite近似t检验，多组间比较采用单因素方差分析，双向P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

EIF5A2在MKN28、HGC27、GES-1细胞及人胃癌和非癌正常胃黏膜组织内的表达qRT-PCR法及Western blot检测结果显示:EIF5A2 mRNA及蛋白在MKN28胃癌细胞内表达水平最高，在GES-1细胞内表达水平最低;EIF5A2蛋白在2例人胃癌组织的表达均明显高于在匹配的非癌正常胃黏膜组织的表达(图1)。

3对EIF5A2 siRNA对EIF5A2 mRNA及编码蛋白的抑制效果与空白对照组比较，转染24 h后，EIF5A2 siRNA#1(P=2.0×10-4)、siRNA#2转染组(P=0.002)EIF5A2 mRNA表达水平均明显下降，其中以siRNA#1转染组下降最明显，但control siRNA(P=0.570)及EIF5A2 siRNA#3转染组 (P=0.231)EIF5A2 mRNA表达水平较空白对照组差异无统计学意义。Western blot检测结果显示:转染48 h后，siRNA#1、siRNA#2转染组EIF5A2蛋白表达水平均较对照组下调，其中以siRNA#1转染组下降最明显(图 2)。

EIF5A2-siRNA#1转染对MKN28细胞增殖能力的影响在细胞接种后0 h，EIF5A2 siRNA#1转染组与control-siRNA转染组细胞增殖能力 (A450吸光度值)差异无统计学意义 (P=0.612);在细胞接种后的24(P=0.003)、48(P＜0.001)、72 h(P＜0.001)，与control-siRNA转染组比较，EIF5A2 siRNA#1转染组细胞增殖能力均明显减弱 (图3)。

EIF5A2-siRNA#1转染对胃癌细胞MKN28迁移、侵袭能力的影响与control-siRNA转染组比较，EIF5A2-siRNA#1转染后明显抑制了MKN28迁移能力(P＜0.001)和侵袭能力 (P＜0.001)(图4)。

图1 EIF5A2在胃癌细胞、永生化正常胃黏膜上皮细胞及人胃癌和非癌胃黏膜组织内的表达Fig 1 Expressions of EIF5A2 in human gastric cancer cell lines and the immortalized gastric mucosal epithelial cell line，gastric adenocarcinoma and the paired distant non-tumor tissues

EIF5A2-siRNA#1对MKN28细胞内相关蛋白表达的影响与对照siRNA转染组相比，EIF5A2 siRNA#1转染组EIF5A2、Cyclin D1、Cyclin D3蛋白及MTA1和C-myc蛋白表达均明显下调，同时EIF5A2 siRNA#1转染组间质指标Vimentin表达明显下调，E-cadherin表达呈上调趋势;对照siRNA转染组与EIF5A2 siRNA#1转染组基质金属蛋白酶-9(metallopeptidase-9，MMP-9)表达水平无明显差异 (图5)。

图2 siRNA转染对EIF5A2 mRNA及蛋白表达的影响Fig 2 Effects of siRNA transfection on EIF5A2 mRNA and protein expressions

图3 EIF5A2-siRNA转染对MKN28细胞增殖的影响Fig 3 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on proliferation of MKN28 cells

图4 EIF5A2-siRNA转染对MKN28迁移、侵袭能力的影响Fig 4 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on the migration and invasion of MKN28 cells

图5 EIF5A2-siRNA#1转染对MKN28细胞内EIF5A2可能靶蛋白表达的影响Fig 5 Effects of EIF5A2-siRNA#1 transfection on the expressions of possible targeting proteins of EIF5A2 in MKN28 cells

讨 论

EIF5A2基因定位在人类染色体3q26.2区，其编码产物作为可能的癌蛋白在多种人类肿瘤内高表达，并与其增殖、侵袭转移和/或预后密切相关［11］。本研究结果发现，抑制EIF5A2可明显抑制MKN28细胞的增殖能力，提示EIF5A2蛋白可能是促进MKN28细胞增殖的重要分子。有研究显示，EIF5A2与肝癌细胞、卵巢癌细胞及结直肠癌细胞的增殖也密切相关［2，7，13］，但EIF5A2调控肿瘤细胞增殖的分子机制尚未阐明。Cyclin D1及Cyclin D3在调控细胞周期，促进胃癌细胞增殖方面可发挥重要作用［14-15］。本研究结果显示，抑制EIF5A2可明显下调MKN28细胞内Cyclin D1和Cyclin D3的表达水平，提示EIF5A2调控Cyclin D1和Cyclin D3可能是促进胃癌细胞增殖的机制之一。

本研究发现，抑制EIF5A2可明显降低MKN28胃癌细胞迁移及侵袭能力。2007年，Marchet等［12］通过基因组筛查法证实EIF5A2基因在预测胃癌淋巴结转移方面可发挥重要作用。近期研究显示，EIF5A2-MTA1/C-myc轴在结直肠癌细胞EMT及侵袭转移调控中可能发挥关键作用［8］。此外有研究证实，EMT程序和MTA1及C-myc分子与胃癌侵袭转移密切相关［16-18］。据此，本研究进一步观察了 siRNA抑制EIF5A2对MKN28细胞内MTA1、C-myc及 EMT相关指标Vimentin和E-cadherin表达的可能影响，结果证实抑制EIF5A2可明显抑制MTA1、C-myc及间质指标Vimentin并上调上皮指标E-cadherin的表达水平。

综上，本研究结果显示，siRNA抑制EIF5A2可明显抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。EIF5A2上调CyclinD1和Cyclin D3可能是促进MKN28胃癌细胞增殖的可能机制之一;EIF5A2上调C-myc、MTA1以及调控EMT可能是促进MKN28胃癌细胞迁移及侵袭的重要机制之一。

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