王 帅，贾琦珍，陈根元，张 玲，马春晖,3*(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔843300；.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300；3.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子83000)

不同生长时期小花棘豆总黄酮含量及其抗氧化活性研究

王 帅1,2，贾琦珍2，陈根元2，张 玲1,2，马春晖2,3*
(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300；3.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子832000)

研究不同生长时期小花棘豆总黄酮含量的变化及其与清除自由基能力的关系。试验选用6个生长时期的小花棘豆作为检测样本，利用甲醇超声波提取总黄酮，并采用硝酸铝显色法测定小花棘豆总黄酮含量，然后通过分析黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除作用，评价其抗氧化能力。结果表明，不同生长时期小花棘豆黄酮含量及自由基清除能力存在着显著差异(P<0.05)，结荚期小花棘豆总黄酮含量和自由基清除能力均高于其它生长期(P<0.05)，小花棘豆黄酮含量与DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力均存在极显著的正相关，其相关系数分别为0.950、0.933和0.972。

小花棘豆；黄酮；自由基；动态变化

小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是豆科棘豆属植物，在新疆分布广泛，是本区草原主要的有毒植物之一，放牧家畜采食小花棘豆后极易发生中毒[1]。自20世纪70年代以来，由于小花棘豆不断地生长蔓延，使牧场草群结构劣变，草地生态恶化，严重威胁着草地畜牧业的发展。但目前研究表明，小花棘豆含有较为丰富的活性物质，据蒙药典记载，小花棘豆能够治疗关节炎、牙痛、神经衰弱等，有麻醉、镇静、止痛等功效。黄酮类化合物是小花棘豆的活性成分之一。于荣敏等[2,3]从小花棘豆地上部分中分离得到了2种黄酮醇、3种黄酮醇甙和1种黄酮甙；罗扬[4]对内蒙古小花棘豆黄酮类物质的含量进行了测定；王帅等[5-6]研究发现小花棘豆黄酮具有较好的抗脂质氧化作用，有作为天然抗氧化剂开发的价值。目前，有关小花棘豆的抗氧化成分分析及不同生长时期小花棘豆抗氧化能力的变化趋势尚未见详细报道。本试验拟通过比较小花棘豆不同生长时期总黄酮含量，采用DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基分析法测定其清除自由基的能力，研究评价小花棘豆黄酮与自由基清除能力之间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小花棘豆采集于新疆阿拉尔市托喀依乡，由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组鉴定。根据物候期观察，小花棘豆在阿拉尔的出苗期为5月下旬，分枝期为6月中下旬，现蕾期为7月上旬，盛花期为7月下旬，结荚期为8月中旬，落叶期为10月上旬。在各时间段内采集不同生长时期的小花棘豆地上部分，阴干，粉碎，过20目筛后备用。

1.2 试剂与仪器

2,2-二苯基-1-苦肼基自由基(DPPH)，德国Sigma；芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司；维生素C(VC)，天津市光复精细化工研究所；甲醇、氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯。 Carry 100型紫外-可见分光光度计，美国Varian； BS124型精密电子天平，德国Sartorius；Direct-Q3型超纯水系统，美国Millipore；KQ-400DB型医用数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 小花棘豆黄酮的提取

试验参考王帅等[7]的小花棘豆黄酮提取方法。精密称取小花棘豆样品10.00 g，加φ=100%甲醇50 mL，超声浸提 45 min，超声波功率 800 w，温度 45 ℃。过滤后残渣再加φ=100%甲醇50 mL浸提 1次，合并滤液，用φ=100%甲醇定容至100 mL，4℃避光保藏，备用。

1.4 小花棘豆黄酮的测定

精密称取芦丁对照品10.0 mg，用φ=100%甲醇溶解，完全移入100 mL容量瓶中，加φ=100%甲醇定容至刻度，摇匀即得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。

准确吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加φ=100%甲醇补至10 mL，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色方法操作，以溶液1为空白，在274 nm波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程A=0.01844C+0.00481，R2=0.9997，表明样品检测浓度在0～32 mg/L的范围内与吸光度线性关系良好。

准确吸取待测样品溶液1.0 mL，平行3份，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色方法操作，测定吸光度，计算黄酮类物质含量。

1.5 小花棘豆黄酮体外抗氧化活性的测定

以VC作为阳性对照，按王燕等[8]的方法测定不同生长时期小花棘豆黄酮对DPPH自由基的清除率。并根据样品对DPPH清除作用曲线计算得到DPPH自由基的起始浓度减少至50%时样品的添加量(IC50)。按蒙秋霞等[9]的研究，以φ=55%乙醇为空白对照，采用邻苯三酚自氧化法测定样品及对照品的超氧阴离子自由基清除率。参照Bosetti等[10]的研究，以改进的水杨酸法测定其清除羟基自由基的能力。

1.6 数据分析

试验数据用Excel处理，数据分析用SPSS 16.0中One-Way ANOVA进行单因素方差分析，差异显著时采用LSD法进行多重比较，结果用平均数±标准差表示，并进行简单相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同生长时期小花棘豆黄酮含量

由表1可知，在不同生长时期中，小花棘豆黄酮含量存在着较大的差异。其中结荚期小花棘豆黄酮含量最高，各生长时期小花棘豆黄酮含量依次为：结荚期﹥现蕾期﹥出苗期﹥盛花期﹥分枝期﹥落叶期。结荚期小花棘豆黄酮含量显著高于出苗期、盛花期和分枝期(P<0.05)，极显著高于落叶期(P<0.01)。

表1 不同生长时期小花棘豆的黄酮含量Table 1 Content of total flavonoid of O.glabra DC in different harvesting periods mg/g

注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Notes:Values with different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05),and the capital letter superscripts mean highly significant difference (P<0.01).The same as below.

2.2 不同生长时期小花棘豆黄酮清除DPPH自由基能力的测定

由图1可知，不同生长时期小花棘豆黄酮清除DPPH自由基的能力存在显著差异。其中结荚期和现蕾期小花棘豆黄酮对DPPH自由基均具有较好的清除效果，其IC50值分别为15.48 mg/L和16.06 mg/L，极显著低于VC的28.80 mg/L(P<0.01)；出苗期、盛花期和分枝期IC50值分别为25.96 mg/L、30.12 mg/L和33.54 mg/L，与VC差异不显著(P>0.05)；落叶期IC50值为106.84 mg/L，极显著高于VC和其它生长期小花棘豆黄酮(P<0.01)。表明小花棘豆黄酮对DPPH自由基具有较好的清除效果，结荚期和现蕾期小花棘豆黄酮对DPPH自由基的清除效果均优于VC。

2.3 不同生长时期小花棘豆黄酮清除超氧阴离子自由基能力的测定

小花棘豆黄酮对超氧阴离子自由基的清除结果表明，不同生长时期小花棘豆黄酮样品的浓度与超氧阴离子的清除率均呈现一定量的正相关关系。其原因可能为黄酮类物质降低了反应体系中O2-自由基浓度，从而加速了邻苯三酚自氧化反应的进行。由图2可知，结荚期和现蕾期小花棘豆黄酮各浓度清除超氧阴离子自由基的效果均好于VC对照；出苗期、盛花期和分枝期小花棘豆黄酮浓度较低时清除率高于VC，但浓度较高时低于VC；落叶期小花棘豆黄酮清除超氧阴离子自由基的效果最差。

图1 小花棘豆黄酮对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Effects of the tlevowoid of O.plabra DC on the DPPH free radical

图2 小花棘豆黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of sample and control on superoxide anion

2.4 不同生长时期小花棘豆黄酮清除羟基阴离子自由基能力的测定

由图3可知，随着小花棘豆黄酮浓度的增加，其清除羟基自由基的活性也随之增加，黄酮质量浓度与羟基自由基清除率呈量效的正相关关系。结荚期、现蕾期、出苗期、盛花期和分枝期小花棘豆黄酮清除羟基自由基的效果均好于VC。

图3 小花棘豆黄酮对羟基阴离子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of sample and control on hydroxide free radical

2.5 小花棘豆黄酮与自由基清除能力的相关性

以DPPH自由基清除率(y)为因变量，小花棘豆黄酮含量(x)为自变量进行相关回归分析，得到方程y=0.196x+18.476，相关系数为0.950；以超氧阴离子自由基清除率(y)为因变量，小花棘豆黄酮含量(x)为自变量进行相关回归分析，得到方程y=0.183x+16.81，相关系数为0.933；以羟基自由基清除率(y)为因变量，小花棘豆黄酮含量(x)为自变量进行相关回归分析，得到方程y=0.174x+17.331，相关系数为0.972。可见，小花棘豆黄酮含量与DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力均存在极显著的正相关(P<0.01)，表明黄酮类物质是小花棘豆清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的主要功效成分。

3 讨 论

黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物，其含量的动态变化与植物体生长发育密切相关，并且受到温度、光照、土壤等生长环境的影响。本试验研究发现，结荚期小花棘豆黄酮含量最高，各生长时期小花棘豆黄酮含量依次为：结荚期﹥现蕾期﹥出苗期﹥盛花期﹥分枝期﹥落叶期。罗扬[4]以内蒙古鄂尔多斯小花棘豆为研究对象，发现8月份小花棘豆总黄酮含量最低，9月份含量最高；各月份的黄酮含量依次为：9月份>5月份>6月份>7月份>8月份，与本试验研究结果差异显著。其原因可能为小花棘豆生长环境的不同所致。Carvalho等[11]研究发现长日照能诱导大量类黄酮途径相关基因的表达，从而显著增加植物叶片中的黄酮醇含量。南疆地区小花棘豆自5月下旬出苗后，叶片不断发育，光合作用不断加强，合成黄酮类物质的原料不断增加，再加上日照时间的延长诱导类黄酮途径相关基因的表达，引起小花棘豆总黄酮含量的提高。分枝期和盛花期小花棘豆黄酮含量低于出苗期，其原因可能为分枝期为小花棘豆器官大量分化形成期，光合产物向其他产物的迅速转化导致光合产物总积累量不够，因而向黄酮类化合物的转化相对不够；盛花期植物需要较多营养物质供给开花，可能使小花棘豆次生代谢产物合成量降低。另外，南疆地区5月以后沙尘天气较多，也可能造成小花棘豆光合作用下降，导致其黄酮含量降低。DPPH 是一类较为稳定的自由基，天然抗氧化物清除 DPPH 自由基的能力在某种程度上可以反映其抗氧化清除自由基的总能力；超氧阴离子自由基是氧气在生物体内形成的第一个自由基，不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它氧离子自由基，进一步对生物产生损害；羟基自由基可破坏生物的细胞膜，降解DNA，对生物机体危害极大。本试验结果表明，小花棘豆黄酮提取液对不同自由基的清除能力均较强，其中结荚期和现蕾期小花棘豆黄酮清除自由基的能力均强于VC对照，表明这两个生长时期的小花棘豆在抗氧化方面具有很大的潜能。不同生长时期小花棘豆黄酮含量差异显著，相关性分析表明，小花棘豆黄酮含量与DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基清除率均呈显著正相关。小花棘豆黄酮含量与其抗氧化能力是完全的线性变化关系，与张艳军等[12]的报道一致。另外，于荣敏等[2,3]研究表明，小花棘豆中黄酮类成分主要以黄酮苷的形式存在，苷元包括芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白杨素、鼠李素、异鼠李素、甲基鼠李素、鼠李柠檬素等。不同生长时期的小花棘豆黄酮含量差异显著，其组成可能也有较大差异。而不同种类、不同结构的黄酮化合物具有不同的抗氧化功效，因此对于不同生长时期小花棘豆黄酮抗氧化活性的研究也更有意义。

根据刘璐等[13]的研究，小花棘豆地上部分黄酮类物质含量显著高于急弯棘豆、黄花棘豆和冰川棘豆，表明小花棘豆在黄酮类化合物的提取和利用方面具有巨大的开发价值，值得进一步研究和探索。

4 结 论

小花棘豆含有较多的黄酮类物质，其不同生长时期总黄酮含量的高低顺序依次是：结荚期>现蕾期>出苗期>盛花期>分枝期>落叶期。小花棘豆黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基均具有较强的清除作用，相关性分析表明小花棘豆黄酮含量与自由基清除率具有极显著的正相关，其中羟基自由基清除能力与小花棘豆黄酮含量的相关性最强。结荚期和现蕾期小花棘豆黄酮清除自由基的能力均强于VC对照。

[1]王 帅,贾琦珍,陈根元,等.新疆小花棘豆的毒性危害与利用[J].新疆畜牧业,2012,37(4):54-55.

[2]于荣敏,李 铣,朱廷儒.小花棘豆中黄酮醇和黄酮醇甙的分离鉴定[J].中国中药杂志,1989,14(8):34-36.

[3]于荣敏,李铣,朱廷儒,等.小花棘豆中黄酮甙的2D-NMR研究[J].波谱学杂志,1991,8(1):99-106.

[4]罗 扬.鄂尔多斯草原小花棘豆黄酮含量及化感作用的研究[D].北京:北京林业大学,2011.

[5]王 帅,张 玲,陈根元,等.小花棘豆黄酮体外抗氧化作用[J].西北农业学报,2012,21(9):145-148.

[6]王 帅,陈根元,蒋 慧,等.小花棘豆总黄酮体内抗氧化作用的研究[J].中国畜牧兽医,2012,39(10):133-136.

[7]王 帅,张 玲,蒋 慧,等.新疆小花棘豆总黄酮提取工艺的研究[J].新疆农业科学,2012,49(7):1 284-1 288.

[8]王 燕,王儒彬,孙 磊,等.不同采摘期连翘叶中总黄酮、总酚酸含量与DPPH自由基清除能力的相关性[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(16):109-112.

[9]蒙秋霞,张丽珍,牛 宇,等.不同生长时期小叶锦鸡儿黄酮类化合物含量的变化动态[J].草地学报,2011,19(6):943-947.

[10]Bosetti C,Rossi M,Mclaughlin J K,et al.Flavonoids and the risk of renal cell carcinoma[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(1):98-101.

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TotalFlavonoidsofOxytropisglabraDCatDifferentGrowthPhasesandtheirAnti-oxidativeAbility

WANG Shuai1,2,JIA Qi-zhen2,CHEN Gen-yuan2,ZHANG Ling1,2,MA Chun-hui2,3*

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang843300,China;2.KeylaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

In the present study,the change of total flavonoids content and antioxidant activity of Oxytropis glabra DC during growth were measured,and the relationship between them was also investigated.O.glabra DC samples were collected in 6 different growth periods,and total flavonoids of O.glabra DC were extracted with methanol by ultrasound-assisted method,the contents of total flavonoids in different growth periods in O.glabra DC were measured using the aluminum nitrate spectrophotometric method,and the antioxidant abilities were estimated by DPPH free radical,superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity.The results showed that total flavonoids content and free radical scavenging activity in O.glabra DC were significantly different throughout growth phases,the sample picked in pod-setting stage had the highest content of total flavonoids and free radical scavenging activity.There were very significant positive relationship between flavonoid content and DPPH free radical,superoxide anion and hydroxyl radical scavenging capacity,with the correlation coefficients being 0.950,0.933 and 0.972.O.glabra DC in pod-setting stage had the highest content of flavonoid,which suggests that O.glabra DC can be considered as a valuable source of antioxidant products.

oxytropis glabra DC; flavonoid; free radical; dynamics

2014-04-12，

2014-05-04

“十二五”国家科技支撑计划子项目(2011BAD17B05);新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(HS201402)

王 帅(1984-)，男，山西长治人，硕士，实验师，主要从事牧草资源开发利用方面的研究。 E-mail:wangshuaidky@126.com

*[通讯作者] 马春晖(1966-)，男，新疆哈密人，博士，教授，博士生导师，主要从事牧草生产与牧草加工方面的研究。 E-mail:chunhuima@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0061-05